Agar TCBS: Justificativa, Preparação e Uso - Ciência - 2023
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o Ágar TCBS é um meio de cultura sólido altamente seletivo e diferencial, utilizado para o isolamento e cultivo de bactérias do gênero Vibrio, principalmente Vibrio cholerae, V. vulnificusY V. parahaemolyticus como os principais patógenos deste gênero.
TCBS significa Tiossulfato Citrato Bile Sacarose.Este ágar também é conhecido como meio seletivo para Vibrios. A fórmula original foi criada por Nakanishi e posteriormente modificada por Kobayashi.
É composto por extrato de levedura, peptona de carne, tripteína, citrato de sódio, tiossulfato de sódio, bile de boi, sacarose, cloreto de sódio, citrato férrico, azul de bromotimol, azul de timol e ágar.
Esta composição permite um desenvolvimento adequado de espécies de Vibrio a partir de amostras de água, alimentos e fezes; exceto Vibrio hollisae, que não cresce neste ambiente. Além disso, o meio TCBS é capaz de inibir o crescimento de outras bactérias acompanhantes, especialmente coliformes.
Devido aos graves problemas gastrointestinais e extra-intestinais produzidos por algumas espécies do gênero Vibrio, seu diagnóstico é muito importante. Os humanos são infectados principalmente pela ingestão de alimentos crus ou mal cozidos do mar ou de águas poluídas, mas também por infecção de feridas.
Por isso, os laboratórios clínicos devem incluir o ágar TCBS no estudo da cultura de fezes de amostras líquidas de fezes, especialmente com o aparecimento de água de arroz. Principalmente se o paciente relatar ter entrado em contato com água do mar ou consumido mariscos ou peixes.
Base
Extrato de levedura, peptonas de carne e tripteína são a fonte nutricional deste meio. No entanto, o ágar TCBS é um meio inóspito para a maioria das bactérias.
Sua alta seletividade é dada pela adição de citrato de sódio e bile de boi; ambos são agentes inibidores que também fornecem um pH alcalino ao meio, restringindo o crescimento da flora acompanhante e favorecendo o crescimento de V. cholerae, entre outras espécies. Cabe ressaltar que Vibrio cholerae é muito sensível à acidez.
Por sua vez, o cloreto de sódio equilibra osmoticamente o meio. Além disso, como sua concentração é elevada, também atua como agente inibidor, favorecendo o crescimento de bactérias halofílicas.
A sacarose é o açúcar fermentável que, juntamente com os indicadores de pH azul de bromotimol e azul de timol, conferem ao meio seu caráter diferencial. Por este motivo, com este meio é possível diferenciar cepas fermentadoras de sacarose das não fermentadoras.
Colônias de cepas de fermentação de sacarose desenvolvem cor amarela e irão transformar o meio de verde para amarelo devido à produção de ácido. Os não fermentadores tornam-se translúcidos e o meio permanece com a cor original (verde).
Da mesma forma, este meio contém tiossulfato de sódio como fonte de enxofre e citrato férrico como agente de desenvolvimento. Ambos apresentam bactérias capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (gás incolor). O H2S é formado a partir de tiossulfato e, subsequentemente, após reação com citrato férrico, forma-se um precipitado preto visível.
Por fim, o ágar é o que dá consistência sólida ao meio.
Preparação
Pesar 89 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Ajuda na dissolução aquecendo e mexendo frequentemente. A mistura pode ser fervida por até 2 minutos.
Este meio não é autoclavado. Após a dissolução, é servido diretamente em pratos esterilizados. Quando se solidificam, são dispostos de forma invertida em plaquetas e armazenados no refrigerador (2-8 ° C) até o uso.
O meio após a preparação deve permanecer a pH 8,6 ± 0,2.
A cor do meio desidratado é bege claro ou bege-esverdeado, e a cor do meio é verde floresta ou verde azulado.
É importante permitir que as placas aqueçam antes de semear as amostras.
Usar
A amostra mais comum para isolamento de Vibrios são fezes diarreicas.
As amostras de fezes, se não puderem ser semeadas imediatamente no meio seletivo, devem ser transportadas no meio Cary Blair.
Para aumentar a sensibilidade da cultura, as fezes podem ser passadas em água peptonada a pH 8,4 como meio de enriquecimento por no máximo 8 horas, a partir daí são subcultivadas em meio TCBS.
Também deve ser levado em consideração que algumas cepas de Vibrios podem causar septicemia em pacientes imunossuprimidos, portanto, podem ser isoladas em hemoculturas. Da mesma forma, amostras de água e alimentos do mar podem ser analisadas quando há surtos de cólera.
Semeado
O inóculo da amostra em estudo deve ser proeminente, a semeadura é realizada pelo método de estriação por exaustão. As placas são incubadas a 37 ° C durante 24 horas em aerobiose.
As presumíveis colônias de Vibrio cholerae São de tamanho médio, lisos, opacos, com bordas finas e de cor amarela devido à fermentação da sacarose.
Da mesma forma, a espécie de V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii e alguns V. vulnificus. Outras espécies de Vibrios clinicamente importantes, como V. parahaemolyticus eles não fermentam a sacarose, desenvolvendo-se como colônias de verde oliva.
Por outro lado, deve-se ter em mente que algumas cepas de Aeromonas e Plesiomonas que são oxidase (+) podem crescer neste meio, desenvolvendo colônias amarelas que podem confundir o clínico. Enquanto algumas cepas de Pseudomonas também oxidase (+) crescem como colônias verdes, assim como V. parahaemolyticus.
Limitação
O teste da oxidase positivo para o gênero Vibrio nunca deve ser realizado em colônias obtidas com ágar TCBS, pois o resultado obtido será um falso negativo. Os compostos intermediários interferem fortemente neste teste. Portanto, deve ser feito a partir de subculturas em ágar sangue.
Controle de qualidade
Para comprovar que o meio está em bom estado, é aconselhável plantar cepas controle conhecidas ou certificadas e observar se o crescimento atende às características esperadas.
Para isso, cepas de:
-Vibrio cholerae -– crescimento satisfatório (colônias amarelas, borda translúcida).
-Vibrio parahaemolyticus -– crescimento satisfatório (colônia com centro verde e borda translúcida).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - crescimento satisfatório (colônias amarelas com halos da mesma cor ao redor da colônia).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - inibição total ou parcial (pequenas colônias amarelas ou translúcidas).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– inibição parcial ou total (colônias azuis).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Completamente inibido.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Inibição total ou parcial. (Fronteira translúcida com centro verde de pequenas colônias).
A incubação do meio não inoculado deve permanecer inalterada.
Referências
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. Ágar TCBS. 2009. Disponível em: f-soria.es
- Laboratório BD. BD. TCBS Agar 2003. Disponível em: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS Medium. 2015. Disponível em: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016. Disponível em: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.