Teste de coagulase: justificativa, procedimento e usos - Ciência - 2023

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o teste de coagulase é uma técnica laboratorial usada para revelar a presença da enzima coagulase. Essa enzima tem a propriedade de coagular o plasma. Loeb em 1903 foi o primeiro a descrever esta enzima.

Este teste é realizado em cocos Gram positivos e catalase positivos, permitindo distinguir as cepas de Staphylococcus aureus do resto dos estafilococos, visto que é o único microrganismo de importância clínica que o produz.

Nesse sentido, os membros da Família Staphylococaceae com teste negativo são frequentemente referidos como Staphylococcus coagulase negativo.

Existem algumas cepas diferentes para S. aureus que pode produzir coagulase, comoStaphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius e S. delphini.


No entanto, os três primeiros são de importância clínica em nível veterinário e muito raramente podem ser encontrados como um agente causador de infecções em humanos, enquanto S. delphini ele é encontrado apenas em ambientes marinhos.

Além disso, eles são facilmente diferenciados porque S. hyicus Y S. intermedius não fermentar manitol e S. schleiferi spp coagulans não fermenta maltose, nem trealose, enquanto S. aureus ele fermenta esses carboidratos.

A presença da enzima coagulase tem sido associada à virulência das cepas. No entanto, esta teoria foi desmoronando, à medida que outras espécies virulentas coagulase negativas capazes de produzir infecções significativas são observadas.

Base

Staphylococcus aureus produz dois tipos de coagulase, uma que permanece ligada à parede celular, também chamada de fator de aglutinação ou fator de coagulase reativo (CRF), e uma extracelular que é liberada em culturas líquidas. É por isso que são chamados de coagulase ligada e coagulase livre, respectivamente.


A enzima coagulase recebe o nome da ação que produz. Esta tem a capacidade de transformar o fibrinogênio em fibrina, criando um coágulo evidente quando encontrada no plasma, ou seja, essa enzima simula a atividade da trombina na cascata de coagulação.

Na verdade, uma das teorias mais amplamente aceitas é que a coagulase ligada reage com a coagulase livre para ativar os fatores de coagulação. Essa ativação gera uma substância que atua de forma semelhante à da protrombina, criando um composto com função da trombina.

A diferença com a cascata normal de coagulação é que essa reação não requer a presença de cálcio e não é afetada pela heparina.

Para realizar o teste da coagulase, basta enfrentar uma cultura a fresco de Staphylococcus com plasma preferencialmente de coelho e, assim, observar a formação ou não do coágulo.

Existem técnicas específicas para detectar a coagulase ligada e a coagulase ligada e livre ao mesmo tempo.


Algumas cepas de S. aureus dar um resultado positivo mais rápido do que outros. A taxa de formação do coágulo é diretamente proporcional à concentração de coagulase presente.

O teste de coagulase em lâmina detecta a coagulase ligada e o teste em tubo detecta a coagulase ligada e a livre.

Processo

- Teste de coagulase deslizante

materiais

- Lâmina limpa

- Plasma de coelho de preferência, plasma humano ou de cavalo também pode ser usado.O plasma pode ser adquirido comercialmente liofilizado e reconstituído para uso, ou pode ser usado fresco (fresco). Outra alternativa viável é o uso de fibrinogênio.

-Solução salina estéril (0,85%) (SSF).

Obtenção de plasma fresco

Extraia sangue venoso humano ou animal. Qualquer um dos seguintes anticoagulantes pode ser usado: EDTA, oxalato de cálcio, heparina ou citrato de sódio. Misture bem e centrifugue. Retire assepticamente o sobrenadante (plasma), sem glóbulos vermelhos e coloque em tubo estéril.

Plasma liofilizado

Reconstitua conforme especificado no frasco do kit comercial.

Fibrinogênio fresco

A partir do plasma citratado, misture o plasma em partes iguais com uma solução saturada de cloreto de sódio. Deixe precipitar e centrifugar.

Descarte o sobrenadante, reconstitua o precipitado até 5 vezes seu volume com água destilada estéril. Adicione 5 unidades de heparina para cada ml de fibrinogênio. Armazene em um tubo estéril.

Técnica

Uma gota de solução salina e uma gota de plasma são colocadas em uma lâmina separadamente. Pegue 1 ou 2 colônias puras do microrganismo para serem testadas com a alça de platina.

Misture a carga bacteriana na gota de plasma e repita a operação na gota de SSF. Observe os resultados imediatamente. Um resultado positivo será aquele em que a formação de um aglutinado macroscópico (precipitado branco) é observada após um minuto no lado da gota de plasma.

A queda de SSF serve como um controle negativo. Se for observada aglutinação com o SSF, isso significa que o microrganismo se autoaglutina, o que pode dar resultados falsos positivos. Neste caso, deve ser confirmado com o tubo de ensaio.

Também é recomendado montar um controle positivo com uma cepa conhecida de S. aureus.

Interpretação

Aglutinação dentro de 5-20 segundos (teste fortemente positivo).

Aglutinação variável ocorrendo entre 20 segundos e um minuto (teste positivo retardado).

Algum grau de aglutinação após um minuto (evidência duvidosa). Recomenda-se repetir o teste ou confirmar pelo método do tubo.

Não há aglutinação (teste negativo).

Resultado com SSF. Deve sempre dar negativo; se der automaticamente positivo, o resultado do teste é invalidado.

-Teste coagulase

materiais

- Tubo de ensaio estéril

-Plasma

- Banho de Maria a 37 ° C.

Técnica

Pipete 0,5 ml de plasma em um tubo de ensaio 12 x 75 com uma pipeta estéril. Carregue o loop de platina com 2 a 4 colônias puras para estudar a partir de uma cultura sólida por 18 a 24 horas e dissolver no plasma cuidadosamente misture e incube a 37 ° C por 4 horas.

Examine o tubo na primeira hora sem sacudi-lo, apenas incline-o suavemente. Se ainda não houver coágulo, ele pode ser observado a cada 30 minutos até o término das 4 horas. Se após 4 horas continuar negativo, pode ser deixado por até 24 horas, mas em temperatura ambiente. Observe e relate o resultado.

Com base na experiência, alguns microbiologistas recomendam o uso de 500 µl de uma suspensão bacteriana de uma cultura de 18 horas em meio líquido para realizar o teste.

Parece oferecer resultados mais rápidos e confiáveis ​​do que ao emulsificar colônias de meios sólidos, especialmente se o plasma humano obtido do banco de sangue foi usado.

O uso de cepas de um caldo ajuda a diluir a possível presença de anticorpos anti-estafilocócicos humanos no plasma que podem inibir a ação da coagulase.

Interpretação

Se for observado um coágulo envolvendo todo o fluido (coagulação completa) ou coágulo sem nada no fluido remanescente (coagulação parcial), deve ser considerado um teste positivo.

Se nenhum coágulo for formado, ou seja, a suspensão permanecer homogênea, o teste é negativo.

- Teste de coagulase com fibrinogênio

O fibrinogênio é usado da mesma forma que o plasma e é adequado para testes em lâmina e tubo. Proceda conforme descrito para o plasma e interprete da mesma maneira.

Usar

É usado para diferenciar o Staphylococcus aureus de estafilococos coagulase negativos.

Controle de qualidade

Tenha novas culturas de uma variedade de S. aureus para ser usado como um controle positivo. Você também pode ter uma tensão de S. epidermidis como um controle negativo.

Limitações

- Um teste positivo não deve ser deixado em incubação por 24 horas, pois o S. aureus produz uma fibrinolisina que dissolve o coágulo.

-Para um teste confiável, deve-se usar plasma fresco ou recém-reconstituído, assim como é importante usar culturas bacterianas frescas (18 a 24 h). Isso evita falsos negativos.

-O teste deve ser realizado em conjunto com um controle negativo e um controle positivo.

-Alguns meios sólidos podem interferir no teste de coagulase. Não é recomendado o uso de colônias de ágar manitol salgado.

-Se for usado plasma citratado, recomenda-se colocar 5 unidades de heparina por ml de plasma para evitar falsos positivos. Isso ocorre porque alguns microrganismos diferentes S. aureus eles podem quebrar o citrato e causar a coagulação do plasma. Neste caso, é aconselhável fazer um teste de Gram e um teste de catalase.

-É importante, no tubo de ensaio, monitorar a reação a cada 30 minutos, pois existem cepas de S. aureus Eles produzem altas concentrações de fibrinolisina e diluem o coágulo recém-formado rapidamente. Evite falsos negativos.

-Ao monitorar o teste, evite sacudir o tubo abruptamente, pois isso pode destruir o início da formação do coágulo que não será restaurado posteriormente, causando falsos negativos.

Referências

  1. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
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  5. "Coagulase."Wikipédia, a enciclopédia livre. 12 de fevereiro de 2019, 04:23 UTC. 22 de abril de 2019, 15:50 wikipedia.org.