DNA recombinante: técnica, aplicações e fundamentos - Ciência - 2023

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o DNA recombinante (RDNA ou rDNA) é uma molécula de ácido nucléico artificial criada em laboratório, integrando segmentos de interesse de dois organismos. Também é conhecido como DNA quimérico, graças à sua propriedade híbrida. Este tipo de DNA não é encontrado na natureza.

A metodologia básica para gerá-lo inclui: (a) a seleção de um DNA alvo e sua inserção em outro fragmento de DNA (geralmente um plasmídeo bacteriano); (b) a introdução deste plasmídeo em uma bactéria, (c) a seleção da bactéria por meio de antibióticos e finalmente (d) a expressão do gene.

A técnica aproveita um conjunto de enzimas que permite copiar e colar fragmentos de DNA específicos a critério do pesquisador.

O objetivo da tecnologia recombinante é, na maioria dos casos, a expressão de uma proteína (conhecida como proteína recombinante) desejada pelo biólogo molecular para pesquisas futuras ou para criar uma proteína de valor comercial e terapêutico - como a insulina humana, por exemplo.

Noções básicas da técnica de DNA recombinante e seu uso em engenharia genética

O dogma central da biologia molecular

Todos os seres orgânicos que conhecemos compartilham várias características.Um deles é a natureza do material genético e a forma como as proteínas são feitas - um processo conhecido como o "dogma" central da biologia molecular.

Com exceção de alguns vírus, todos os organismos armazenam informações genéticas no DNA (ácido desoxirribonucléico), coletadas de forma muito compacta e organizada no núcleo da célula.

Para a expressão gênica, a molécula de DNA é transcrita em RNA mensageiro, e este é traduzido para a linguagem dos aminoácidos, os blocos de construção das proteínas.

O que é um DNA recombinante?

Entre as décadas de 1970 e 1980, os biólogos moleculares começaram a tirar proveito dos processos que ocorrem naturalmente no interior da célula e conseguiram extrapolá-los para o laboratório.

Dessa forma, um gene de origem animal (um vertebrado, por exemplo) poderia ser inserido em um segmento de DNA de uma bactéria; ou o DNA de uma bactéria pode ser combinado com um DNA viral. Assim, podemos definir um DNA recombinante como uma molécula composta de DNA de dois organismos diferentes.

Uma vez que esta molécula híbrida ou recombinante foi criada, o gene de interesse é expresso. Com a palavra expressão queremos nos referir ao processo de tradução em proteína.

Enzimas de restrição e ligases: a chave para o processo

Um elemento chave no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante foi a descoberta de enzimas de restrição.

São moléculas de proteínas que apresentam a capacidade de clivar DNA (nucleases) em sequências específicas, servindo como “tesouras moleculares”. Os fragmentos gerados por essas enzimas são chamados de fragmentos de restrição.

As referidas enzimas podem produzir cortes simétricos na sequência alvo (em ambas as cadeias na mesma altura) ou cortes assimétricos. Um aspecto fundamental da ação das enzimas de restrição é que após a clivagem das cadeias, uma "borda solta" é obtida, complementar à outra borda cortada pela mesma enzima.

Alguns exemplos são ECOR 1 e Sma 1. Atualmente, mais de 200 tipos de enzimas de restrição são conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

Para ser útil, uma tesoura deve vir acompanhada da cola. Esta ação de selamento do DNA (previamente tratado com enzimas de restrição) é realizada por ligases.

Técnica: como o DNA de um organismo é modificado artificialmente em laboratório?

A seguir, descreveremos as principais etapas que a tecnologia do DNA recombinante requer. Todos são realizados por profissionais de um laboratório de biologia molecular.

O que é um "clone"?

Antes de continuar com o protocolo experimental, devemos observar que em biologia molecular e biotecnologia o termo "clone" e o verbo "clone" são amplamente utilizados. Isso pode causar confusão.

Neste contexto, não estamos nos referindo à clonagem de tudo um organismo (como no caso da famosa ovelha Dolly, por exemplo), mas à clonagem de um pedaço de DNA, que pode ser um gene. Ou seja, produzam muitas cópias - geneticamente idênticas - da sequência.

1. Isolamento e obtenção de DNA

A primeira etapa é decidir qual sequência você deseja usar. Isso depende inteiramente do pesquisador e dos objetivos de seu trabalho. Este DNA deve então ser isolado e purificado. Os métodos e procedimentos para conseguir isso dependem, por sua vez, do corpo e dos tecidos.

Geralmente, um pedaço de tecido é retirado e submetido ao tratamento em um tampão de lise com proteinase K (uma enzima proteolítica) e, em seguida, o DNA é extraído. Posteriormente, o material genético é fragmentado em pequenos fragmentos.

2. Vetor de clonagem

Após as etapas preparatórias, o pesquisador busca introduzir o segmento de DNA de interesse em um vetor de clonagem. De agora em diante, chamaremos esse segmento de DNA de DNA branco.

Plasmídeos

Um dos vetores mais usados em um plasmídeo de origem bacteriana. Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular de fita dupla encontrada naturalmente nas bactérias. Eles são estranhos ao cromossomo bacteriano - ou seja, são extracromossômicos e são encontrados naturalmente nesses procariotos.

Os elementos básicos de um vetor são: (a) uma origem de replicação, que permite a síntese de DNA; (b) agente de seleção, que permite identificar os organismos que carregam o plasmídeo com o DNA alvo, como resistência a algum antibiótico; e (c) local de multiclonagem, onde se encontram as sequências que serão reconhecidas pelas enzimas de restrição.

O primeiro DNA recombinante bem-sucedido em laboratório foi clonado no plasmídeo pSC101 da bactéria E. coli. Ele contém um sítio de restrição para a enzima de restrição EcoRI e um gene de resistência a antibióticos, além da origem de replicação.

A inserção do DNA alvo no plasmídeo é realizada usando as ferramentas moleculares de enzimas de restrição e ligases descritas na seção anterior.

Tipos de vetor restantes

Além dos plasmídeos, o DNA pode ser inserido em outro vetor, como bacteriófago lambda, cosmídeos, YACs (cromossomos artificiais de levedura), BACs (cromossomos artificiais bacterianos) e fagemídeos.

3. Introdução de DNA recombinante

Uma vez obtida a molécula de DNA recombinante (gene de interesse no plasmídeo ou outro vetor), ela é introduzida em um hospedeiro ou organismo hospedeiro, que pode ser uma bactéria.

Para introduzir DNA estranho em uma bactéria, é utilizada uma técnica chamada transformação bacteriana, em que o organismo é submetido a um tratamento com cátions divalentes que o torna suscetível a captar DNA.

Metodologicamente, não podemos garantir que 100% das bactérias em nossa cultura tenham efetivamente absorvido nossa molécula de DNA recombinante. É aqui que entra em ação a porção do plasmídeo que contém resistência aos antibióticos.

Assim, a bactéria que absorveu o plasmídeo será resistente a um determinado antibiótico. Para selecioná-los, bastará aplicar o referido antibiótico e levar os sobreviventes.

4. "Colher" a proteína

Depois de selecionar a bactéria com nosso DNA recombinante, passamos a usar a maquinaria enzimática do hospedeiro para gerar o produto proteico de interesse. À medida que as bactérias se reproduzem, o plasmídeo é passado para seus descendentes, portanto, não é perdido durante a divisão.

Esse procedimento utiliza a bactéria como uma espécie de "fábrica" de proteínas. Mais tarde veremos que tem sido um procedimento muito relevante no desenvolvimento de tratamentos médicos eficazes.

Uma vez que a cultura está pronta e a bactéria produziu grandes quantidades de proteína, a célula é lisada ou rompida. Existe uma vasta gama de técnicas bioquímicas que permitem a purificação de proteínas de acordo com as suas características físico-químicas.

Em outro contexto experimental, podemos não estar interessados em gerar a proteína, mas sim em obter a sequência de DNA per se. Se fosse esse o caso, o plasmídeo seria usado para criar várias cópias do fragmento de interesse, a fim de ter DNA suficiente para realizar os experimentos relevantes.

Formulários

A tecnologia do DNA recombinante abriu um número infinito de possibilidades em biologia molecular, biotecnologia, medicina e outras áreas relacionadas. Suas aplicações mais destacadas são as seguintes.

Análise genética

A primeira aplicação está diretamente relacionada a laboratórios de biologia molecular. A tecnologia do DNA recombinante permite que os pesquisadores entendam a função normal dos genes, e as proteínas geradas podem ser usadas em pesquisas futuras.

Indústria farmacêutica

As proteínas produzidas pelo procedimento do DNA recombinante têm aplicações na medicina. Dois exemplos muito relevantes na área são a insulina humana e o hormônio do crescimento, que é aplicado em pacientes que carecem dessa proteína.

Graças ao DNA recombinante, essas proteínas podem ser geradas sem a necessidade de extraí-las de outro ser humano, o que representa complicações metodológicas adicionais e riscos à saúde. Isso ajudou a melhorar a qualidade de vida de inúmeros pacientes.

Referências

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