Coloração Kinyoun: justificativa e técnicas - Ciência - 2023

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Coloração Kinyoun: justificativa e técnicas - Ciência
Coloração Kinyoun: justificativa e técnicas - Ciência

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o Mancha Kinyoun é uma técnica de coloração usada para corar bactérias ácido-resistentes e parasitas. Nasceu da modificação da coloração Ziehl-Neelsen; Ambas as técnicas são interpretadas da mesma forma, mas diferem em dois elementos: na preparação do reagente principal e na técnica de Kinyoun não utilizar calor.

Por esta razão, também é conhecida como mancha fria de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modificada a frio. É indicado para a coloração de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, micobactérias atípicas, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris Y Cyclosporas cayetanensis.

É importante ressaltar que Nocardia cora fracamente com esta técnica por serem parcialmente resistentes ao álcool-ácido, portanto para este gênero há uma modificação da metodologia.


Por sua vez, a técnica de Kinyoun frio foi combinada com a técnica de tricrômio modificada por Didier para a detecção de coccídios (Cryptosporidium parvum e Isospora belli) e esporos de microsporidia (Enterocytozoon bieneusi Y Encephalitozoon intestinalis).

Base

O principal reagente de coloração é a carbolfucsina ou carbolfucsina, que tem a propriedade de se ligar aos ácidos carbólicos existentes na parede celular cerosa rica em lipídios (ácidos micólicos) de micobactérias e certos parasitas.

Essa ligação não é neutralizada pelo alvejante ácido; portanto, os microrganismos são definidos como álcool-ácido rápido.

Ao contrário da técnica de Ziehl-Neelsen -que fixa o corante por meio do calor-, na técnica de Kinyoun esta etapa não é necessária, pois a solução de fucsina carbólica preparada para esta técnica contém uma alta concentração de fenol.

O fenol dissolve o material lipídico da parede celular, permitindo a entrada do corante carbolfuchsin. Depois que o corante penetra, ele permanece fixo, apesar da lavagem com álcool ácido.


Desse modo, os microrganismos álcool-ácido resistentes adquirem a cor vermelha característica, ao passo que tudo o que não é ácido-resistente fica descolorido e manchado de azul.

Técnica

materiais

- Fucsina carbol modificada.

- Álcool-ácido.

- Azul de metileno.

Preparação de Kinyoun Carbol Fuchsin

- Fucsina básica: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- Álcool (95%): 20 ml.

- Água destilada: 100 ml.

A fucsina básica deve ser dissolvida lentamente no álcool, misturando constantemente. Posteriormente, o fenol cristalizado é derretido em banho-maria a 56 ° C. Uma vez dissolvido, 8 ml são adicionados à solução de fucsina preparada acima.

Preparação do ácido-álcool

- Ácido clorídrico concentrado: 3 ml.

- Etanol (95%): 97 ml.

Deve ser medido, unido e misturado.

Preparação do corante de contraste azul de metileno

- Azul de metileno: 0,3 g.


- Água destilada: 100 ml.

É pesado e dissolvido.

Técnica de coloração Kinyoun

1- Preparar um esfregaço diretamente da amostra, que pode ser escarro, líquido pulmonar, sedimento urinário, líquido cefalorraquidiano ou fezes, entre outros; ou de uma suspensão de microrganismos obtidos de colônias puras desenvolvidas em meios de cultura primários.

2- Fixe o esfregaço com calor.

3- Coloque o esfregaço na ponte de coloração e cubra com o reagente Kinyoun carbol fucsina preparado. Deixe descansar por 3 ou 5 minutos.

4- Lave com água destilada.

5- Lixívia com álcool ácido por 3 minutos e lave novamente com água destilada.

6- Lixívia novamente com álcool ácido por 1 ou 2 minutos até que não haja mais coloração.

7- Lave com água destilada e deixe escorrer, colocando a lâmina na posição vertical.

8- Cubra o preparado com azul de metileno e deixe agir por 4 minutos.

9- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.

10- Examine a 40X e depois a 100X.

Para melhorar e acelerar a coloração de microrganismos álcool-ácido resistentes, adicione 1 gota de um agente umectante (como o Tergitol nº 7) a 30 ou 40 ml de Kinyoun Carbol Fuchsin.

Alguns laboratórios mudam o corante de contraste azul de metileno para verde brilhante ou ácido pícrico; o primeiro dá uma cor verde ao fundo e o segundo gera uma cor amarela.

Técnica especial de Kinyoun para Nocardias

Uma modificação da coloração Kinyoun é usada para melhorar a coloração de bactérias do gênero Nocardia. A técnica é a seguinte:

1- Cubra o esfregaço com carbol-fucsina Kinyoun por 3 minutos.

2- Lave com água destilada.

3- Descolorir brevemente com álcool ácido preparado a 3% até que não haja mais coloração.

4- Lave novamente com água destilada.

5- Cubra o preparado com azul de metileno e deixe agir por 30 segundos.

6- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.

Técnica combinada de carbol fucsina e tricrômico modificada por Didier

Esta técnica é recomendada para a análise de amostras de fezes para coccídios e esporos de Microsporidium sp ao mesmo tempo. O procedimento a seguir é o seguinte:

1- Cubra o esfregaço com carbol-fucsina Kinyoun por 10 minutos.

2- Retire a tintura e lave com água destilada.

3- Lixívia por 30 segundos com álcool ácido clorídrico.

4- Lave novamente com água destilada.

5- Cubra o esfregaço com solução tricrômica por 30 minutos a 37 ° C.

6- Lave com água destilada.

7- Lixívia por 10 segundos com álcool ácido acético.

8- Lave o esfregaço por 30 segundos com etanol 95%.

Controle de qualidade

Como controle positivo, os esfregaços são preparados com cepas de Mycobacterium tuberculosis e corar com os reagentes preparados para verificar se as bactérias adquirem a cor adequada (vermelho-fúcsia).

Os controles negativos também podem ser usados ​​preparando esfregaços com qualquer cepa que não seja ácido-resistente, verificando assim se toda a amostra tem a cor de contraste.

Técnica Kinyoun comparada à técnica Ziehl-Neelsen

A técnica de Kinyoun é mais simples, pois elimina a etapa de aquecimento, mas sua principal vantagem é evitar a emissão de vapores, altamente tóxicos e cancerígenos em longo prazo. Portanto, a coloração Kinyoun é mais segura para o pessoal de coloração.

É importante levar em consideração que se deve ter cuidado para que os reagentes não entrem em contato direto com a pele, pois são corrosivos e o alvejante é inflamável.

Quanto às desvantagens, um esfregaço negativo não indica necessariamente que o organismo não está presente. Além disso, a presença de detritos celulares pode levar a falsos positivos, levando a confusão no diagnóstico.

Referência

  1. Química Clínica Aplicada. (2016). Kit BK Kinyoun. Disponível em: cromakit.es
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  6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementação de uma técnica de coloração para o diagnóstico simultâneo de Coccidia e Microsporidia. Instituto de Higiene da Universidade da República. Montevidéu. Uruguai. Disponível em: Hygiene.edu.uy