Caldo Malonate: base, preparação e utilizações - Ciência - 2023

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o caldo malonato é o meio de cultura líquido utilizado para o teste diagnóstico (teste do malonato), utilizado para diferenciar alguns gêneros da família Enterobacteriaceae. Foi criado por Leifson em 1933 e posteriormente modificado por Ewing, que adicionou uma pequena quantidade de dextrose e extrato de levedura à fórmula original.

O meio é atualmente composto de extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, cloreto de sódio, malonato de sódio, dextrose e azul de bromotimol. Este teste é geralmente incluído na bateria de identificação bioquímica de Enterobacteriaceae, ajudando a diferenciar certos gêneros e espécies.

O teste do malonato baseia-se principalmente na capacidade de alguns microrganismos de usar malonato de sódio como única fonte de carbono e sulfato de amônio como fonte de nitrogênio.

O teste do malonato é geralmente positivo em algumas espécies dos gêneros Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Considerando que, a maioria das espécies dos gêneros Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providencia apresentam reação negativa.

Base

O teste do malonato consiste em mostrar as bactérias capazes de usar o malonato de sódio como única fonte de carbono e o sulfato de amônio como fonte de nitrogênio.

A maioria das Enterobacteriaceae que não usa malonato são capazes de crescer neste meio, tendo como nutrientes a dextrose e o extrato de levedura.

Nesse caso, qualquer tentativa de alcalinização pelo uso de peptonas será neutralizada pela produção de ácidos gerados pela fermentação da dextrose. Da mesma forma, os fosfatos dipotássico e monopotássico atuam como tampão, mantendo o pH em 6,7.

Por isso, quando o teste é negativo, o caldo permanece com a mesma cor original (verde). Em raras ocasiões, o meio pode se tornar ácido devido à fermentação da dextrose; sem o uso das peptonas e do indicador de pH tornaria a cor do meio amarelada. Para que isso aconteça, o pH deve cair para 6.

Porém, quando esse teste é positivo, diz-se que o microrganismo utilizou malonato e sulfato de amônio como fontes de carbono e nitrogênio respectivamente, sem fazer uso dos demais componentes.

Nesse caso, o meio torna-se alcalino devido à liberação de sódio e conseqüente formação de NaOH. Nesse sentido, o indicador de pH (azul de bromotimol) muda a cor do meio de verde para azul quando o pH é igual ou superior a 7,6. O azul pode ser claro ou intenso (azul da Prússia).

Finalmente, o cloreto de sódio mantém a osmolaridade do meio e a água é o diluente de todos os componentes.

Interpretação

Caldo da mesma cor (verde) - Teste negativo

Caldo amarelo: teste negativo

Caldo azul claro ou profundo: teste positivo

Existe uma variante chamada caldo de malonato de fenilalanina, também chamada de meio de Shaw e Clarke. Nesse caso, dois testes podem ser analisados, o uso do malonato como fonte de carbono e a produção de ácido pirúvico a partir da fenilalanina.

Preparação

Caldo Malonate

Pesa-se a quantidade de gramas especificada no encarte da empresa comercial escolhida (pode variar de um para outro). Os gramas pesados são suspensos em um litro de água destilada. Aquecer ligeiramente até dissolver completamente. Distribua 3 ml do meio em tubos de ensaio 13/100 com tampas de algodão.

Esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 a 20 minutos.

Esfrie antes de usar. Se não forem usados imediatamente, guarde na geladeira até o uso. Leve os caldos à temperatura ambiente antes de inocular.

O pH do meio deve ser 6,7 ± 0,2. A cor do meio preparado é verde garrafa.

Caldo Malonato de Fenilalanina

Pesar 11 g do meio desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. O resto da preparação é igual ao descrito anteriormente.

Também pode ser preparado adicionando 2 g / L de fenilalanina ao meio caldo malonato antes de ser esterilizado.

Usar

É usado como parte da bateria de testes bioquímicos que são montados para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae.

Ajuda a distinguir entre:

-O gênero Klebsiella e Enterobacter (+) do gênero Escherichia e Serratia (-).

-Espécies deSalmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica salame ssp e Salmonella enterica ssp diarizonae (+), da espécie Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Do gênero Klebsiella geralmente (+) do gênero Actinobacillus (-).

- Ocasionalmente, pode ajudar na diferenciação de gêneros e espécies de bactérias não pertencentes à família Enterobacteriaceae, como entre os bacilos Gram negativos não fermentadoresAlcaligenes faecalis (+) e Acinetobacter sp (-).

Processo

Sob um isqueiro, uma porção de uma colônia pura é retirada, usando um cabo de platina devidamente esterilizado e resfriado. A amostra retirada (inoculo leve) é dissolvida no caldo de malonato. Incubar com a tampa solta em aerobiose a 35 ° C ± 0,2 por 24 a 48 horas.

O caldo malonato também pode ser inoculado de uma cultura de 18-24 horas em caldo de tripticase de soja. Neste caso, com uma pipeta estéril retira 0,01 ml e inocula-se o caldo malonato. Incubar com a tampa solta em aerobiose a 35 ° C ± 0,2 por 24 a 48 horas.

Após o tempo, os resultados são interpretados. Qualquer vestígio de cor azul após 48 horas de incubação deve ser considerado positivo. O teste não deve ser interpretado como negativo antes de decorridas as 48 horas de incubação.

No caso de usar a variante do caldo de malonato de fenilalanina, o malonato é primeiro interpretado e, em seguida, são adicionadas 5 gotas de HCl 1N e 3-5 gotas de cloreto férrico a 8%. Uma cor verde escura é interpretada como um teste positivo para fenilalanina. Se, pelo contrário, o meio ficar azul claro, o teste é negativo para fenilalanina.

Controle de qualidade

Para realizar o controle da esterilidade do meio, um ou dois caldos devem ser incubados a 35 ° C ± 0,2 por 24 horas de incubação. Após este período, não deve haver turvação ou mudança de cor.

Cepas conhecidas ou certificadas podem ser usadas para controle de qualidade, como: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 e Escherichia coli ATCC 25922.

Os resultados esperados são:

Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae Y Salmonella enterica ssp arizonae dar reação positiva (cor azul médio).
Para Escherichia coli o resultado deve ser negativo, ou seja, espera-se que não haja mudança de cor (verde) ou que fique amarelo devido à fermentação da glicose.

Limitações

Não use caldos que apresentem turvação, precipitados, mudança de cor ou qualquer sinal de deterioração.

Referências

Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Isolamento microbiológico de Salmonella spp. e ferramentas moleculares para sua detecção. Uninorte Health. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Disponível em: scielo.org.co
BBL. Caldo Malonate, Ewing modificado. 2007. Disponível em: bd.com
Senna Laboratories. Caldo Malonato. Disponível em: cientificasenna.com
RenyLab. Caldo Malonato. 2013. Disponível em: es.renylab.ind.br
Mbiolog Diagnostics. Caldo Malonato. Disponível em: mbiolog.com
Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
Laboratórios Conda Pronadisa. Caldo de malonato de fenilalanina. Disponível em: condalab.com