Coloração Giemsa: justificativa, materiais, técnica e usos - Ciência - 2023

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Coloração Giemsa: justificativa, materiais, técnica e usos - Ciência
Coloração Giemsa: justificativa, materiais, técnica e usos - Ciência

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o Mancha de Giemsa É um tipo de coloração de amostras clínicas, baseado na mistura de corantes ácidos e básicos. Sua criação foi inspirada no trabalho de Romanowsky, onde Gustav Giemsa, químico e bacteriologista originário da Alemanha, o aperfeiçoou adicionando glicerol para estabilizar os compostos.

As mudanças geradas na técnica original de Romanowsky permitiram melhorar consideravelmente as observações microscópicas, pois a técnica foi batizada com o nome de coloração de Giemsa.

Por ser uma técnica simples de realizar, altamente funcional e de baixo custo, é atualmente muito utilizada em laboratório clínico para esfregaços hematológicos, amostras de medula óssea e cortes de tecidos.

A técnica de coloração de Giemsa é muito útil para estudos citológicos, pois permite a observação de estruturas celulares específicas. Esta técnica cora os citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacúolos e grânulos das células, sendo capaz de distinguir até traços finos de cromatina.


Além disso, podem ser detectadas alterações significativas no tamanho, forma ou coloração do núcleo, onde é possível visualizar a perda da relação núcleo-citoplasma.

Por outro lado, permite a identificação de células imaturas na medula óssea e no sangue periférico, sendo importante para o diagnóstico de doenças graves como a leucemia. Também é possível detectar hemoparasitas, bactérias extra e intracelulares, fungos, entre outros.

Na citogenética é amplamente utilizado, pois é possível estudar a mitose das células.

Base de coloração Giemsa

Os corantes do tipo Romanowsky são baseados no uso de um contraste entre os corantes ácidos e básicos, para conseguir a coloração das estruturas básicas e ácidas, respectivamente. Como pode ser visto, existe uma afinidade por corantes ácidos para corar estruturas básicas e vice-versa.

O corante básico usado é o azul de metileno e seus derivados oxidados (Azure A e Azure B), enquanto o corante ácido é a eosina.


As estruturas ácidas das células são os ácidos nucléicos, os grânulos dos basófilos segmentados, entre outros, portanto serão corados com azul de metileno.

Nesse mesmo sentido, as estruturas básicas das células são a hemoglobina e alguns grânulos como os contidos nos eosinófilos segmentados, entre outros; estes serão corados com eosina.

Por outro lado, pelo fato de o azul de metileno e o azul se caracterizarem por serem corantes metacromáticos, eles podem fornecer uma tonalidade variável às diferentes estruturas de acordo com a carga de polianions que possuem.

É assim que a combinação estratégica de corantes básicos e ácidos consegue desenvolver um amplo espectro de cores, de acordo com as características bioquímicas de cada estrutura, caminhando pelos tons de azul claro, azul escuro, lilás e roxo no caso de estruturas ácidas.

Já a coloração proporcionada pela eosina é mais estável, gerando cores entre o laranja-avermelhado e o salmão.


materiais

Materiais para preparar a solução de estoque

A preparação da solução estoque requer o peso de 600 mg de corante Giemsa em pó, medindo 500 cc de álcool metílico sem acetona e 50 cc de glicerina neutra.

Como preparar a solução de estoque

Coloque o pó de Giemsa pesado em um pilão. Se houver caroços, eles devem ser pulverizados. Em seguida, adicione uma quantidade apreciável da glicerina medida e misture muito bem. A mistura obtida é despejada em uma garrafa âmbar bem limpa.

O resto da glicerina é colocado na argamassa. Misture novamente para limpar o resto do corante que grudou nas paredes da argamassa e adicione no mesmo frasco.

O frasco é tampado e colocado em banho-maria a 55ºC por 2 horas. Enquanto estiver em banho-maria, agite levemente a mistura a cada meia hora ou mais.

Posteriormente, a mistura é deixada esfriar para colocar o álcool. Anteriormente, uma parte do álcool medido é colocada na argamassa para finalizar a lavagem do corante restante e, em seguida, é adicionada à mistura junto com o restante do álcool.

Esta preparação deve ser deixada para amadurecer por pelo menos 2 semanas. A porção usada da solução estoque deve ser filtrada.

Para evitar a contaminação do preparo, recomenda-se transferir a porção que ficará em uso constante para um pequeno frasco âmbar com conta-gotas. Reabasteça toda vez que o reagente acabar.

Materiais para preparar a solução tampão

Por outro lado, uma solução tampão em pH 7,2 é preparada da seguinte forma:

6,77 g de fosfato de sódio (anidro) (NaHPO) são pesados4), 2,59 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) e água destilada até 1000 cc.

Preparação final do corante

Para a preparação da solução de coloração final, 2 ml da solução estoque filtrada são medidos e misturados com 6 ml da solução tampão. A mistura é agitada.

Um fato relevante que deve ser levado em consideração é que as técnicas de preparo da coloração podem variar dependendo da casa comercial.

Materiais adicionais necessários para realizar a coloração

Além dos materiais descritos, é necessário ter pontes de coloração, camisetas com água ou buffer para lavagem, slides para objetos ou tampas de objetos, cronômetro para controlar os tempos de coloração e papel absorvente ou algum material que sirva para secar ( gaze ou algodão).

Técnica

Processo de coloração

1) Antes da coloração, o esfregaço da amostra em uma lâmina limpa deve estar pronto.

As amostras podem ser sangue, medula óssea, cortes histológicos de tecido ou amostras cérvico-vaginais. Recomenda-se que os cremes para barrar sejam finos e tenham 1 ou 2 horas de secagem antes da coloração.

2) Em uma ponte para colorir, coloque todas as folhas que devem ser coloridas. Você sempre trabalha na mesma ordem e cada folha está bem identificada.

3) Colocar algumas gotas de álcool metílico 100% (metanol) no esfregaço e deixar agir por 3 a 5 minutos, para fixar e desidratar a amostra.

4) Descarte o metanol presente na folha e deixe secar ao ar.

5) Depois de seco, coloque a solução de coloração final com um conta-gotas até que toda a folha esteja coberta. Deixe agir por 15 minutos. Alguns autores recomendam até 25 min. Depende da casa de negócios.

6) Drene a mancha e lave o esfregaço com água destilada ou com uma solução tampão 7.2.

7) Sobre um papel absorvente, deixe as folhas secarem ao ar livre, dispostas verticalmente com o auxílio de um suporte.

8) Limpe o verso da lâmina com um cotonete de álcool ou algodão para remover quaisquer vestígios de mancha.

Serviços de utilidade pública

A técnica de coloração de Giemsa é utilizada em várias áreas, entre elas: hematologia, micologia, bacteriologia, parasitologia, citologia e citogenética.

Hematologia

É o uso mais comum dado a esta mancha. Com ele, é possível identificar todas e cada uma das células presentes em amostras de medula óssea ou sangue periférico. Além de estimar o número de cada série, podendo detectar leucocitose ou leucopenia, trombocitopenia, etc.

Por ser sensível na identificação de células imaturas, é relevante no diagnóstico de leucemias agudas ou crônicas. Também é possível fazer o diagnóstico de anemias, como anemia falciforme, falciforme, entre outras.

Micologia

Nesta área é comum usá-lo para pesquisar Histoplasma capsulatum (fungo dimórfico intracelular) em amostras de tecido.

Bacteriologia

Em esfregaços hematológicos corados com Giemsa é possível detectar Borrelias sp em pacientes com a doença chamada febre recorrente.As espiroquetas são abundantes entre os eritrócitos, em amostras colhidas no pico da febre.

Também é possível visualizar bactérias intracelulares, como Rickettsias sp Y Chlamydia trachomatis em células infectadas.

parasitologia

No campo da parasitologia, a coloração de Giemsa tem permitido o diagnóstico de doenças parasitárias como malária, doença de Chagas e leishmaniose.

Nos primeiros dois parasitas Plasmodium sp e ele Trypanosome cruzi respectivamente, podem ser visualizados no sangue periférico de pacientes infectados, podendo ser encontrados em diferentes estágios dependendo da fase em que a doença se encontra.

Para melhorar a pesquisa de parasitas no sangue, recomenda-se usar a coloração Giemsa misturada com a coloração May-Grünwald.

Da mesma forma, a leishmaniose cutânea pode ser diagnosticada avaliando amostras de biópsia de pele coradas com Giemsa onde o parasita foi encontrado.

Citologia

A coloração de Giemsa também é utilizada para o estudo citológico de amostras endocervicais, embora não seja a técnica mais utilizada para esse fim.

Mas em casos de recursos escassos pode ser utilizado, tendo funcionalidade semelhante à oferecida pela técnica de Papanicolaou e com menor custo. No entanto, isso requer experiência por parte do examinador.

Citogenética

Uma característica relevante da coloração com Giemsa é sua capacidade de se ligar fortemente às regiões ricas em adenina e timina do DNA. Isso permite que o DNA seja visualizado durante a mitose celular, em diferentes estados de condensação.

Esses estudos são necessários para detectar aberrações cromáticas, como duplicações, deleções ou translocações das diferentes regiões dos cromossomos.

Pesquisa que demonstra a eficácia da coloração Giemsa

Cannova et al (2016), compararam 3 técnicas de coloração para o diagnóstico de leishmaniose cutânea.

Para fazer isso, eles usaram amostras obtidas de um animal experimental (Mesocrisetus auratus)inoculado experimentalmente com Leishmania.

Os autores demonstraram que a coloração de Giemsa foi melhor do que a coloração de Pap-mart® e Gaffney. Portanto, consideraram a coloração de Giemsa ideal para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar.

Os excelentes resultados obtidos pelos autores devem-se ao fato de que a combinação de corantes que compõem a mistura de Giemsa apresenta as condições necessárias para criar um contraste favorável, permitindo que as estruturas dos amastigotas sejam claramente distinguidas, tanto intra quanto extracelularmente.

As outras técnicas (Pap-mart® e Gaffney) também o fizeram, mas de forma mais fraca e, portanto, mais difícil de visualizar. É por isso que a coloração Giemsa é recomendada para o diagnóstico parasitológico da leishmaniose.

Da mesma forma, um estudo de Ramírez et al (1994) avaliou a validade das colorações de Giemsa e Lendrum em esfregaços de conjuntiva para a identificação de Chlamydia trachomatis.

Os autores determinaram que as colorações Giemsa e Ledrum têm especificidade igual, mas Giemsa foi considerado mais sensível.

Isso explica por que a coloração de Giemsa é atualmente a mais usada para o diagnóstico de infecções por clamídia, especialmente se houver poucos recursos.

Recomendações para uma boa coloração

A secagem das folhas não deve ser acelerada. Você deve esperar um tempo razoável para secar ao ar livre. Aproximadamente 2 horas.

Pinte imediatamente após 2 horas para melhores resultados.

Para que os esfregaços fixem e manchem melhor, a amostra deve ser distribuída na lâmina de forma que permaneça uma camada fina e uniforme.

A amostra de sangue preferida é a capilar, pois o esfregaço é feito diretamente da gota de sangue e, portanto, a amostra não contém aditivos, o que favorece a manutenção das estruturas celulares.

No entanto, se for usado sangue venoso, o EDTA deve ser usado como anticoagulante e não a heparina, pois a heparina geralmente deforma as células.

Erros comuns na coloração de Giemsa

Na prática desta coloração podem ser cometidos erros. Eles são evidenciados por mudanças repentinas nas tonalidades das estruturas.

Coloração extremamente azul

Pode ser devido a:

  • Manchas muito espessas
  • Excedendo o tempo de coloração
  • Lave insuficientemente.
  • Uso de reagentes bem acima do pH neutro (alcalino).

Nessas condições, as cores das seguintes estruturas são distorcidas, de modo que os eritrócitos, em vez de corar rosa-salmão, ficarão verdes, os grânulos dos eosinófilos que devem ser corados de vermelho tijolo ficarão azulados ou cinza e assim por diante desvio nos tons usuais.

Coloração excessivamente rosa

Pode ser devido a:

  • Tempo de coloração insuficiente.
  • Lavagem prolongada ou excessiva.
  • Secagem ruim.
  • Uso de reagentes altamente ácidos.

Neste caso específico, as estruturas que normalmente ficam com manchas de azul não serão quase visíveis, enquanto as estruturas que ficam com manchas de rosa terão tons muito exagerados.

Exemplo: Os eritrócitos ficarão vermelhos ou laranja brilhantes, a cromatina nuclear ficará rosa pálida e os grânulos de eosinófilos ficarão vermelhos.

Presença de precipitados no esfregaço

As causas podem ser:

  • Use filmes sujos ou mal lavados.
  • Não deixe o esfregaço secar bem.
  • Deixando a solução fixadora por muito tempo.
  • Lavagem inadequada no final da coloração.
  • Filtragem inadequada ou nenhuma filtragem do corante sendo usado.

Presença de artefatos morfológicos

Artefatos morfológicos podem aparecer em manchas, dificultando a visualização e interpretação das estruturas presentes. Isto é porque:

  • Tipo de anticoagulante usado, como heparina.
  • Uso de filmes sujos, deteriorados ou gordurosos.

Modo de armazenamento

Após a preparação, o corante deve ser mantido em temperatura ambiente (15 - 25 ° C), para evitar a precipitação do corante. Deve ser armazenado em um recipiente âmbar bem fechado.

Referências

  1. Cannova D, Brito E e Simons M. Avaliação de técnicas de coloração para o diagnóstico de leishmaniose cutânea. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. Reagentes PanReac Applichem ITW. Coloração Giemsa. Versão 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espanha.
  3. Clark G. Staining procedures (1981), 4thed. Williams e Willkins.
  4. Química Clínica Aplicada. Coloração Giemsa para diagnóstico em vitro. Distribuidor: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F e Grazioso C. Validade das manchas de Giemsa e Lendrum em esfregaços de conjuntiva para a identificação de Chlamydia trachomatis.Bol de Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincón G. Micologia Geral. 1994. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, Edições da Biblioteca. Venezuela Caracas.
  7. "Mancha de Giemsa."Wikipédia, a enciclopédia livre. 1 de setembro de 2017, 01:02 UTC. 6 de dezembro de 2018, es.wikipedia.org.