Caldo de uréia: base, preparação e usos - Ciência - 2023

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o caldo de ureia É um meio de cultura líquido, utilizado para mostrar a presença da enzima urease em determinados microrganismos. A urease é uma enzima microbiana produzida constitutivamente, ou seja, é sintetizada independentemente da presença ou não do substrato sobre o qual atua.

A função da urease está relacionada à decomposição de compostos orgânicos. Nem todos os microrganismos são capazes de sintetizar essa enzima, portanto sua determinação em laboratório permite a identificação de certas cepas bacterianas e até a diferenciação entre espécies do mesmo gênero.

Existem dois tipos de teste de ureia: Stuart e Christensen. Eles diferem em composição e sensibilidade. O primeiro é especial para mostrar uma grande quantidade de urease produzida por espécies do gênero Proteus.


O segundo é mais sensível e pode detectar pequenas quantidades de urease geradas tardiamente por outros gêneros bacterianos, como Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter e Mycobacterium.

O Caldo de Ureia Stuart's é composto por Ureia, Cloreto de Sódio, Fosfato Dipotássico, Fosfato Monopotássico, Extrato de Levedura, Vermelho de Fenol e Água Destilada.

Já o caldo de uréia ou ágar de Christensen é composto de peptonas, cloreto de sódio, fosfato monopotássico, glicose, uréia, vermelho de fenol, água destilada e ágar-ágar. Este último apenas se for o meio sólido.

Base

A enzima urease hidrolisa a ureia para formar dióxido de carbono, água e duas moléculas de amônia. Esses compostos reagem para formar o produto final denominado carbonato de amônio.

Caldo de Ureia Stuart

O caldo de uréia de Stuart é mais tamponado com um pH de 6,8. Portanto, o microrganismo deve ser capaz de formar grandes quantidades de amônia para tornar o fenol vermelho. O pH deve subir acima de 8.


Portanto, o caldo de uréia de Stuart é seletivo para espécies de Proteus, dando resultados positivos em 24 a 48 horas de incubação, e não é eficaz para bactérias que produzem baixas quantidades de urease ou que hidrolisam lentamente a uréia.

Isso ocorre porque as espécies de Proteus são capazes de usar a uréia como fonte de nitrogênio. Em vez disso, outras bactérias produtoras de urease precisam de uma fonte adicional.

No entanto, Pérez et al. (2002) determinaram que o caldo de uréia de Stuart foi tão eficiente quanto o ágar uréia de Christensen na determinação de urease em cepas de levedura dos gêneros Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon e Saccharomyces.

Os autores do estudo afirmam ter alcançado 100% de concordância com ambos os meios (Stuart e Christensen) ao incubar por 24 e 48 horas; com a exceção de que as cepas que conseguiram transformar a mídia em uma cor rosa-fúcsia forte foram consideradas positivas.

Esse esclarecimento é necessário, uma vez que Lodder (1970) afirma que quase todas as leveduras conseguem transformar o bisel do ágar uréia Christensen em rosa claro. Isso se deve ao fato de que eles podem hidrolisar a ureia em quantidades mínimas e à formação de aminas por descarboxilação oxidativa dos aminoácidos na superfície. Isso não deve ser considerado positivo.


Agar ou caldo de uréia de Christensen

O caldo de uréia ou ágar de Christensen é menos tamponado, sendo capaz de detectar pequenas quantidades de amônia. Além disso, este meio é enriquecido com peptonas e glicose. Esses compostos fazem crescer outros microrganismos produtores de urease que não crescem no caldo Stuart.

Da mesma forma, o teste de uréia Christensen oferece resultados mais rápidos, especialmente para Proteus, podendo dar fortemente positivo em apenas 30 minutos como tempo mínimo e até 6 horas como tempo máximo.

O resto dos microrganismos produtores de urease conseguem mudar a cor do meio ligeiramente após 6 horas, e fortemente após 24, 48, 72 horas ou mais, e mesmo algumas cepas podem apresentar reações fracas após 5 ou 6 dias.

Interpretação de ambas as mídias (Stuart e Christensen)

O meio é originalmente de cor amarelo-laranja e uma reação positiva mudará a cor do meio para rosa-fúcsia. A intensidade da cor é diretamente proporcional à quantidade de amônia produzida.

Uma reação negativa deixará o meio com a cor original, com exceção das leveduras, que podem ficar rosa claro com meio de ágar uréia de Christensen.

Preparação

Caldo de Ureia Stuart

Pesar os gramas necessários de acordo com as indicações da empresa comercial. Dissolva em água destilada preferencialmente estéril. Não use calor para se dissolver, pois a uréia é sensível ao calor.

O método de filtração por membrana é usado para esterilizar. Um filtro Millipore com poros de 0,45 µ de diâmetro é usado para isso.Não use autoclave. Depois de filtrada, a solução é distribuída em tubos estéreis. Para obter resultados confiáveis, deve-se transferir entre 1,5 ml como quantidade mínima e 3 ml como quantidade máxima por tubo.

Guarde na geladeira e aqueça antes de usar.

Se o método de filtração não estiver disponível, o meio deve ser usado imediatamente para obter resultados confiáveis.

Outra maneira de preparar o Caldo de Ureia Stuart é a seguinte:

Algumas casas comerciais vendem o meio básico para o teste de uréia, sem incluir a uréia.

A quantidade indicada pela empresa comercial é pesada. É dissolvido em água destilada e esterilizado em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixar repousar um pouco e quando o meio estiver morno, adicionar 100 ml de uma solução de uréia preparada a 20% e esterilizada por filtração.

É distribuído em tubos estéreis, conforme descrito anteriormente.

Agar ou caldo de uréia de Christensen

-Preparação da solução de ureia

Pesar 29 g de ureia desidratada e dissolver em 100 ml de água destilada. Use o método de filtração para esterilizar. Não autoclave.

- Ágar base uréia

Dissolva 24 g do ágar básico desidratado em 950 ml de água destilada. Esterilize na autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixar repousar até atingir a temperatura de 50 ° C e adicionar a ureia previamente preparada assepticamente.

Despeje 4 a 5 ml em tubos estéreis e incline até ficar sólido. Deve haver um bico longo de flauta.

Este meio também pode ser preparado na forma líquida.

Formulários

O teste da uréia é extremamente eficaz em distinguir o gênero Proteus de outros gêneros da Família Enterobacteriaceae, dada a rápida reação proporcionada por Proteus.

Usando a composição de Christensen, o teste ajuda a diferenciar entre espécies do mesmo gênero. Por exemplo,S. haemolyticus e S. warneri sem Estafilococo coagulase negativa e beta-hemolíticos, mas eles diferem nisso S. haemolyticus é ureia negativa e S. warneri é ureia positiva.

Por outro lado, McNulty usou com sucesso o caldo de uréia a 2% de Christensen para estudar a presença de Helicobacter pylori em amostras de biópsia retiradas da mucosa gástrica (região antral).

A presença de H. pylori é evidenciado por um teste de ureia positivo. O tempo de duração para observar os resultados é diretamente proporcional à quantidade de microrganismos presentes.

Como pode ser visto, é um método simples para o diagnóstico de Helicobacter pylori em biópsias gástricas.

Por último, este teste também é útil para diferenciar espécies dos gêneros Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus e Mycobacteria.

Semeando o teste de ureia

Ambos os métodos requerem um inóculo microbiano forte para otimizar os resultados. As colônias bacterianas são preferencialmente retiradas do ágar sangue e leveduras do ágar Sabouraud, com algumas exceções. O inóculo é emulsionado no meio líquido.

Para o caldo de uréia Stuart, incube a 37ºC por 24 a 48 horas, sabendo que você só está procurando cepas de Proteus quando a cepa for uma bactéria. Para a levedura, pode ser incubado a 37 ° C ou à temperatura ambiente por 24 a 48 horas de incubação.

No caso do caldo de uréia de Christensen, ele é incubado a 37 ºC por 24 horas. Se o teste for negativo, pode ser incubado por até 6 dias. Se o teste der positivo antes de 6 horas, indica que se trata de uma cepa do gênero Proteus.

No caso do ágar ureia de Christensen, o bisel do ágar é fortemente inoculado sem punção. O caldo é incubado e interpretado da mesma forma.

Controle de qualidade

As cepas de controle podem ser usadas para testar o meio, comoProteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 eSalmonella typhimurium. Os dois primeiros devem dar resultados positivos e os dois últimos resultados negativos.

Referências

  1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Utilização do caldo de ureia Stuart para o teste da urease, como teste no diagnóstico de leveduras. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Disponível em: Scielo.org.
  2. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  4. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  5. Britannia Laboratories. Meio Christensen (base de ágar ureia) 2015. Disponível em: britanialab.com