Endonucleases: funções, tipos e exemplos - Ciência - 2023

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As endonucleases são enzimas que cortam as ligações fosfodiéster localizadas dentro da cadeia de nucleotídeos. Os locais de restrição de endonuclease são altamente variados. Algumas dessas enzimas cortam o DNA (ácido desoxirribonucléico, nosso material genético) em quase qualquer lugar, ou seja, são inespecíficas.

Em contraste, existe outro grupo de endonucleases que são muito específicas na região ou sequência a ser clivada. Este grupo de enzimas é conhecido como enzimas de restrição e são muito úteis em biologia molecular. Neste grupo temos as enzimas bem conhecidas Bam HI, Eco RI e Alu I.

Ao contrário das endonucleases, existem outro tipo de proteínas catalíticas - exonucleases - que são responsáveis por quebrar as ligações fosfodiéster no final da cadeia.

Endonucleases de restrição

Endonucleases de restrição ou enzimas de restrição são proteínas catalíticas responsáveis pela clivagem das ligações fosfodiéster dentro da cadeia de DNA em sequências muito específicas.

Essas enzimas podem ser adquiridas de várias empresas de biotecnologia e seu uso é quase essencial nas técnicas atuais de manipulação de DNA.

As endonucleases de restrição são nomeadas usando as primeiras letras do nome científico binomial do organismo de onde vêm, seguidas da cepa (opcional) e terminando com o grupo de enzimas de restrição ao qual pertencem. Por exemplo, Bam HI e Eco RI são endonucleases amplamente utilizadas.

A região do DNA que a enzima reconhece é chamada de sítio de restrição e é única para cada endonuclease, embora várias enzimas possam coincidir nos sítios de restrição. Este sítio geralmente consiste em uma curta sequência palindrômica com cerca de 4 a 6 pares de bases de comprimento, como AGCT (para Alu I) e GAATTC para Eco RI.

As sequências palindrômicas são sequências que, embora lidas na direção 5 'para 3' ou 3 'para 5', são idênticas. Por exemplo, para o caso de Eco RI, a sequência palindrômica é: GAATTC e CTTAAG.

Funções e aplicações de endonuculos de restrição

Felizmente para os biólogos moleculares, as bactérias desenvolveram no curso da evolução uma série de endonucleases de restrição que fragmentam internamente o material genético.

Na natureza, essas enzimas evoluíram - presumivelmente - como um sistema de proteção bacteriana contra a invasão de moléculas de DNA estranhas, como as dos fagos.

A fim de discriminar entre o material genético nativo e estranho, essas endonucleases de restrição podem reconhecer sequências de nucleotídeos específicas. Assim, o DNA que não possui essa sequência pode permanecer inalterado dentro da bactéria.

Em contraste, quando a endonuclease reconhece o sítio de restrição, ela se liga ao DNA e o corta.

Os biólogos estão interessados em estudar o material genético dos seres vivos. No entanto, o DNA é composto de vários milhões de pares de bases de comprimento. Essas moléculas são extremamente longas e devem ser analisadas em pequenos fragmentos.

Para cumprir este objetivo, as endonucleases de restrição são integradas em vários protocolos de biologia molecular. Por exemplo, um gene individual pode ser capturado e replicado para análise futura. Esse processo é chamado de "clonagem" de um gene.

Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP)

Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição referem-se ao padrão de sequências de nucleotídeos específicas no DNA que as endonucleases de restrição são capazes de reconhecer e cortar.

Graças à especificidade das enzimas, cada organismo é caracterizado por um padrão de corte específico no DNA, originando fragmentos de comprimentos variáveis.

Tipos de endonucleases de restrição

Historicamente, as endonucleases de restrição foram classificadas em três tipos de enzimas, designadas por algarismos romanos. Recentemente, um quarto tipo de endonuclease foi descrito.

Tipo I

A característica mais importante das endonucleases do tipo I é que elas são proteínas compostas de várias subunidades. Cada uma dessas funções como um único complexo de proteína e geralmente tem duas subunidades chamadas R, duas M e uma S.

A porção S é responsável pelo reconhecimento do sítio de restrição no DNA. A subunidade R, por sua vez, é essencial para a clivagem e M é responsável por catalisar a reação de metilação.

Existem quatro subcategorias de enzimas do tipo I, conhecidas pelas letras A, B, C e D, que são de uso comum. Esta classificação é baseada na complementação genética.

As enzimas do tipo I foram as primeiras endonucleases de restrição a serem descobertas e purificadas. No entanto, os mais úteis em biologia molecular são o tipo II, que será descrito na próxima seção.

Tipo II

As endonucleases de restrição do tipo II reconhecem sequências de DNA específicas e clivam em uma posição constante perto de uma sequência que produz 5 'fosfatos e 3' hidroxilas. Eles geralmente requerem íons de magnésio (Mg²⁺), mas há alguns que têm requisitos muito mais específicos.

Estruturalmente, eles podem aparecer como monômeros, dímeros ou mesmo tetrâmeros. A tecnologia recombinante usa endonucleases do tipo II e por esta razão mais de 3.500 enzimas foram caracterizadas.

Tipo III

Esses sistemas enzimáticos são compostos por dois genes, chamados mod Y carne, codificação para subunidades que reconhecem DNA e para modificações ou restrições. Ambas as subunidades são necessárias para a restrição, um processo totalmente dependente da hidrólise do ATP.

Para clivar a molécula de DNA, a enzima deve interagir com duas cópias da sequência de reconhecimento não palíndrômica e os sítios devem estar em orientação reversa no substrato. A clivagem é precedida por uma translocação de DNA.

Tipo IV

Um grupo adicional foi identificado recentemente. O sistema é composto de dois ou mais genes que codificam para proteínas que clivam apenas sequências de DNA modificadas, seja glicosil metilado, hidroximetilado ou hidrometilado.

Por exemplo, a enzima EckKMcrBC reconhece dois dinucleotídeos da forma geral RmC; uma purina seguida por uma citosina metilada, que pode ser separada por vários pares de bases - de 40 a quase 3000. A clivagem ocorre cerca de 30 pares de bases após o local que a enzima reconhece.

Endonucleases tipo V

Endonucleases deste tipo também são conhecidas como endonucleases "teleguiado”. Essas enzimas reconhecem e cortam a sequência de DNA alvo em locais únicos no genoma de 14 a 40 bp.

Essas enzimas são frequentemente codificadas em íntrons e acredita-se que sua função seja a de promover a transferência horizontal de sequências de corte. Após o corte, ocorre um reparo de quebra na dupla hélice do DNA com base na sequência complementar.

Exemplos

Endonuclease I de E. coli atua como um sistema de defesa contra fagos e parasitas. Ele está localizado principalmente entre a membrana citoplasmática e a parede celular. Ele produz quebras de fita dupla no DNA estranho com o qual interage no espaço periplasmático.

As endonucleases CRISPR-Cas são enzimas que atuam no mecanismo de defesa de diversos tipos de bactérias. Eles identificam e cortam sequências específicas de DNA de organismos invasores, que geralmente são vírus.

Recentemente, pesquisadores do Massachusetts Institute of Technology (MIT) descobriram o sistema de edição de genoma CRISPR-Cas12bm com alta precisão para a modificação de células humanas.

Referências

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