Imunofluorescência: justificativa, protocolo e aplicações - Ciência - 2023

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o imunofluorescência é uma técnica de imunocoloração poderosa que usa anticorpos covalentemente ligados a moléculas fluorescentes para identificar alvos específicos em amostras de células fixadas em um suporte sólido.

Essa técnica envolve observação microscópica com especificidade imunológica, permitindo observar células vivas ou mortas que podem apresentar quantidades minúsculas de antígenos. É amplamente utilizado tanto no campo da pesquisa quanto no diagnóstico clínico de diversas patologias.

Esta técnica, principalmente qualitativa (com algumas variantes quantitativas), tem a ver especificamente com a visualização de uma amostra pelo sinal de produto de um fluoróforo, que é uma molécula fluorescente ligada a um anticorpo e que é capaz de ser excitada em um determinado comprimento de onda .

No contexto celular, é muito útil estudar a presença / ausência e localização subcelular de proteínas. A técnica foi usada inicialmente no ambiente clínico para o diagnóstico de vírus como a gripe e, posteriormente, para muitas outras doenças infecciosas.

É uma técnica altamente sensível e, com o equipamento de microscopia adequado, pode ter resolução muito boa. Requer, para sua observação, o uso de microscópios confocais ou de epifluorescência.

Porém, apesar de muito popular, pode apresentar alguns problemas importantes no que diz respeito à obtenção de fluorescência inespecífica que gera algum “ruído” de fundo, o que muitas vezes limita a leitura adequada dos resultados.

Base

A imunofluorescência é baseada na exploração do fenômeno biológico da reação de interação entre um anticorpo e um antígeno. Tem a ver especificamente com a visualização ou detecção dessa reação, estimulando moléculas fluorescentes em um comprimento de onda específico.

Um anticorpo é uma proteína imunoglobulina secretada por células B ativas, que é gerada especificamente contra um antígeno, ao qual pode se ligar com grande afinidade e especificidade. A imunofluorescência utiliza imunoglobulinas IgG, que são solúveis no soro sanguíneo.

Os anticorpos são moléculas de até 950 kDa compostas por duas cadeias peptídicas curtas (leves) e duas longas em forma de Y (pesadas). Tanto a cadeia leve quanto a pesada são divididas em dois domínios: uma variável, capaz de reconhecer o antígeno, e outra constante ou conservada, característica de cada espécie.

Os antígenos são funcionalmente definidos como moléculas que podem ser reconhecidas por um anticorpo e são, em sua maioria, proteínas. Quando um animal é exposto a um antígeno, os linfócitos do sistema imunológico são ativados, produzindo anticorpos específicos contra ele e que funcionam como sistema de defesa.

Um antígeno, como uma proteína, por exemplo, pode ter mais de um epítopo ou local de reconhecimento por um anticorpo, de modo que o soro do animal exposto a um antígeno pode ter anticorpos policlonais contra diferentes regiões da mesma proteína.

A imunofluorescência, então, explora a capacidade de um animal de produzir anticorpos policlonais contra um antígeno específico para purificá-lo e usá-lo posteriormente para a detecção do mesmo antígeno em outros contextos.

Entre os corantes ou moléculas fluorescentes mais usados para algumas técnicas de imunofluorescência estão isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina-5 e 6 (TRITC), muitos cianinos como Cy2, Cy3, Cy5 e Cy7 e corantes chamados Alexa Fluor® , como Alexa Fluor®448.

Protocolo

O protocolo de imunofluorescência varia dependendo de muitos fatores, no entanto, em termos gerais, ele abrange uma sequência linear de etapas que consiste em:

Preparação das placas e células
Fixação de amostras
Permeabilização
Bloqueando
Imunocoloração ou imunocoloração
Montagem e observação

-Preparação

Das amostras

A preparação das amostras dependerá da sua natureza e do tipo de experiência a realizar. O caso mais simples, que envolve o uso de células em suspensão, será explicado a seguir.

As células em suspensão, ou seja, em meio de cultura líquido, devem primeiro ser separadas por centrifugação e depois lavadas com solução tampão ou "amortecedor" isosmótico, preservando sua integridade.

Normalmente é usado um tampão fosfato-salino conhecido como PBS, no qual as células são ressuspensas e essa mistura é centrifugada novamente para obter as células livres do meio de cultura, que podem conter substâncias interferentes.

Das lâminas

As lâminas utilizadas para observação microscópica, onde as células serão posteriormente fixadas para os respectivos tratamentos a jusante, também devem ser cuidadosamente preparadas.

Estes são recobertos ou "sensibilizados" com uma solução de polilisina, um polímero sintético que atuará como uma "cola molecular" entre as células e o suporte sólido, graças à interação eletrostática entre as cargas positivas de seus grupos amino e os cargas negativas nas proteínas que revestem as células.

Fixação de amostras

Esse processo consiste em imobilizar as proteínas encontradas no interior da célula para manter intacta sua localização espacial. As moléculas utilizadas devem ser capazes de cruzar todos os tipos de membranas celulares e formar redes com proteínas covalentes.

Formaldeído e paraformaldeído, glutaraldeído e até mesmo metanol são amplamente utilizados, com os quais amostras de células são incubadas por certo tempo e depois lavadas com solução tampão isosmótica.

Após a fixação das células, elas continuam a ser fixadas às lâminas previamente sensibilizadas com polilisina.

Permeabilização

Dependendo do tipo de teste realizado, será necessário permeabilizar ou não as células em estudo. Se o que se busca é saber a localização, presença ou ausência de determinada proteína na superfície celular, a permeabilização não será necessária.

Por outro lado, se você quiser saber a localização de uma proteína dentro da célula, a permeabilização é essencial e consistirá na incubação das amostras com Triton X-100, um detergente capaz de permeabilizar as membranas celulares.

Bloqueando

Uma etapa fundamental em todas as técnicas imunológicas é o bloqueio. Nessa etapa do procedimento, o bloqueio consiste em cobrir, nas lâminas sensibilizadas, todos os sítios com moléculas de polilisina às quais as células não aderiram. Ou seja, evita qualquer ligação não específica.

Normalmente, soluções com albumina de soro bovino (BSA) em tampão PBS são utilizadas para o bloqueio e os melhores resultados são obtidos quanto maior o tempo de incubação com esta solução. Após cada etapa, incluindo o bloqueio, é necessário lavar o restante da solução.

Imunocoloração ou imunocoloração

A imunocoloração ou procedimento de imunocoloração dependerá principalmente de se tratar de uma imunofluorescência direta ou indireta (ver abaixo).

Se for imunofluorescência primária ou direta, as amostras serão incubadas com os anticorpos desejados, que devem ser acoplados aos corantes fluorescentes. O procedimento de incubação consiste em fazer uma diluição do anticorpo em uma solução que também conterá BSA, mas em menor proporção.

Quando se tratar de imunofluorescência secundária ou indireta, devem ser realizadas duas incubações consecutivas. Primeiro com os anticorpos desejados e depois com os anticorpos que são capazes de detectar as regiões constantes das imunoglobulinas primárias. São esses anticorpos secundários que se ligam covalentemente aos fluoróforos.

A técnica é muito versátil, permitindo a marcação simultânea de mais de um antígeno por amostra, desde que haja anticorpos primários acoplados a diferentes fluoróforos, no caso da imunofluorescência direta.

Para marcação simultânea em imunofluorescência indireta, é necessário garantir que cada anticorpo primário seja produzido em um animal diferente, bem como que cada anticorpo secundário seja acoplado a um fluoróforo diferente.

Como o bloqueio, a incubação com anticorpos dá melhores resultados quanto mais tempo leva. Após cada etapa é necessário lavar o excesso de anticorpos que não se ligaram às amostras e na imunofluorescência secundária é necessário bloquear antes de adicionar o anticorpo secundário.

Certas técnicas usam outras manchas que não estão relacionadas à imunocoloração, como a coloração do DNA nuclear com o fluoróforo DAPI.

Montagem e observação

Durante o tempo final de incubação com os fluoróforos é necessário que as amostras permaneçam no escuro. Para a observação ao microscópio, é comum o uso de algumas substâncias para preservar a fluorescência dos fluoróforos acoplados aos anticorpos.

Tipos

Imunofluorescência direta ou primária

Tem a ver com a detecção de antígenos pelo uso de anticorpos fluorescentes. A principal vantagem da utilização dessa técnica é a rapidez, porém muitos casos de ligações inespecíficas podem ocorrer no processo, principalmente no estudo de soros humanos, por serem ricos em anticorpos altamente heterogêneos.

Imunofluorescência indireta ou secundária

É também conhecida como técnica "sanduíche" e envolve o desenvolvimento da técnica em duas etapas. A primeira tem a ver com o uso de um anticorpo não fluorescente e sua ligação ao antígeno de interesse.

Contra a região constante deste primeiro anticorpo (que agora servirá como antígeno) é utilizado um segundo anticorpo capaz de reconhecê-lo, o qual está associado a uma molécula fluorescente.

O aparecimento de um sinal fluorescente será o resultado do reconhecimento específico entre o primeiro anticorpo não fluorescente e o antígeno de interesse; a presença deste primeiro anticorpo condiciona a do segundo, que é marcado e graças ao qual a presença ou ausência do antígeno pode ser determinada.

Apesar de ser uma técnica muito mais demorada do que a imunofluorescência direta (pois inclui mais uma etapa de incubação), essa técnica não implica no desenho de um anticorpo fluorescente para cada antígeno estudado, o que resulta, em termos econômicos, mais viável.

Além disso, é uma técnica mais sensível em termos de amplificação do sinal, uma vez que mais de um anticorpo secundário pode se ligar à região constante do anticorpo primário, amplificando a intensidade do sinal fluorescente.

Formulários

Como pode-se notar anteriormente, a imunofluorescência é uma técnica extremamente versátil, que tem tido uma multiplicidade de utilizações no campo científico e clínico. Ele pode ser usado para responder a questões ecológicas, genéticas e fisiológicas relacionadas a muitos organismos.

Dentre as aplicações clínicas, é utilizado para o diagnóstico direto de algumas doenças dermatológicas, seja pela imunofluorescência direta ou indireta no tecido epitelial dos pacientes estudados.

As técnicas de imunofluorescência estão disponíveis em organismos unicelulares, como leveduras, para visualizar microtúbulos intranucleares e citoplasmáticos, actina e proteínas associadas, filamentos de 10 nm e outros constituintes do citoplasma, membrana e paredes celulares.

Referências

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