Agar de dextrose de batata: justificativa, preparação e uso - Ciência - 2023

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o agar batata dextrose É um meio de cultura nutritivo sólido e não seletivo. Nele podem crescer espécies bacterianas e fúngicas, mas seu uso é especialmente indicado para o isolamento de fungos filamentosos e leveduras. É também conhecido como meio PDA para a expressão inglesa Potato Dextrose Agar.

É particularmente útil para o isolamento de fungos fitopatogênicos, ou seja, aqueles que afetam as plantas. Para semear as amostras de vegetais infectados, outros meios como ágar Sabouraud ou ágar malta podem ser usados, no entanto, para uso rotineiro ágar dextrose de batata é o preferido porque obtém maior esporulação.

Também é usado para a contagem de colônias de fungos em amostras de cosméticos, produtos farmacêuticos e alguns alimentos lácteos. Da mesma forma, é adequado para semear amostras de raspados de pele em busca de dermatófitos, que crescem muito bem neste meio, desenvolvendo seus pigmentos característicos.

O meio de dextrose de batata é um meio muito simples e fácil de preparar em laboratório. Contém, como o próprio nome indica, infusão de batata, dextrose e ágar-ágar. Além disso, substâncias inibidoras podem ser adicionadas para prevenir o crescimento bacteriano e aumentar a seletividade para espécies de fungos.

Base

O ágar batata dextrose é um meio de cultura que fornece os elementos nutricionais necessários para o desenvolvimento de fungos filamentosos e leveduras.

A combinação da infusão de batata com a glicose fornece a fonte de energia perfeita para um crescimento satisfatório dos fungos. Já o ágar é quem dá consistência ao meio.

O meio por si só não inibe o crescimento de bactérias, portanto é um meio não seletivo. Para torná-la seletiva, é necessária a adição de substâncias inibidoras, como ácido tartárico ou antibióticos.

Preparação

- Preparação caseira (não comercial) de ágar batata dextrose

Placas de petri

É preparado da seguinte forma:

Em primeiro lugar, as batatas são muito bem lavadas, retirando o solo que possuem. Eles são cortados em fatias finas com tudo e casca. 200 gramas de batatas são pesadas e fervidas em um litro de água destilada por meia hora.

No final, filtre ou coe todo o preparado com uma gaze.

O líquido obtido é completado com água destilada até um litro. Adicionar 20 g de ágar-ágar e 20 g de dextrose à infusão, misturar bem e autoclave a 121 ° C, a 15 libras de pressão por 15 minutos.

Deixe esfriar a 50 ° C e sirva em placas de Petri estéreis. Os pratos preparados são armazenados no refrigerador.

Cunhas

Também podem ser preparadas fatias de ágar de dextrose de batata.

Neste caso, antes de esterilizar na autoclave, 12 a 15 ml do meio são colocados em tubos, posteriormente são autoclavados e ao deixarem deitarem em suportes especiais até que se solidifique. Guarde na geladeira.

O meio permanece com pH de 5,6 ± 0,2, porém alguns laboratórios adicionam ácido tartárico a 10% para baixar o pH para 3,1 ± 0,1 a fim de inibir o crescimento bacteriano.

Nesse mesmo sentido, outros laboratórios preferem adicionar antibióticos para torná-lo seletivo para o cultivo de fungos e prevenir o crescimento bacteriano.

- Preparação comercial de ágar batata dextrose

Pesar 39 g do meio desidratado comercialmente disponível e dissolver em um litro de água destilada. Deixe descansar por 5 minutos.

A mistura é aquecida com agitação frequente até estar completamente dissolvida. Posteriormente, é esterilizado em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Pratos ou fatias podem ser preparados. Proceda conforme descrito anteriormente.

O pH permanece em 5,6 ± 0,2. Se o pH de 3,1 for desejado, 14 ml de ácido tartárico 20% estéril devem ser adicionados antes de servir nos pratos.

O meio bruto é bege e o meio preparado é âmbar claro com uma aparência ligeiramente turva ou opalescente.

Formulários

Processo para o plantio de amostras de plantas em ágar batata dextrose

-Para folhas manchadas

As folhas são cortadas em pedaços.

Em um copo de 50 cc com álcool 50%, coloque os pedaços das folhas (pedaços manchados e saudáveis), para desinfetar a superfície por 20 a 30 segundos. Jogue fora o álcool e adicione hipoclorito de sódio a 20% por 40 a 50 segundos se forem folhas finas e aumente o tempo para 80 segundos se for casca e toros.

Descarte o hipoclorito de sódio e retire as peças desinfetadas com pinça estéril e coloque-as sobre a superfície do meio (máximo de 10 peças). Defina a data e incube a 20-30 ° C.

-Para frutas e tubérculos

Se o fruto for carnudo, abra o fruto afetado pelo fungo e tire os pedaços com bisturi estéril, tanto da parte doente quanto da parte sadia, e coloque na superfície do ágar.

Se a fruta for cítrica, como um limão ou uma laranja, ela deve ser aberta e suas sementes plantadas.

Quando a superfície da fruta é afetada e esporos são observados, o ideal é usar o método de ralar no prato; Consiste em tocar os esporos com uma espátula esterilizada e resfriada em forma de “L” e, em seguida, semear em zigue-zague 2 a 3 vezes no ágar.

-Para grãos

São desinfetados conforme descrito nas folhas e posteriormente colocados no ágar.

-Para ramos e caules

A casca é raspada e, em seguida, pedaços são retirados da parte sadia e doente e semeados diretamente no ágar.

As placas semeadas são incubadas aerobicamente a 20-30 ° C durante 72 horas.

Processo para semear amostras de pele, cabelo ou escama de unha em ágar batata dextrose

A coleta deve ser feita com lâmina de bisturi nº 11, seja para cortar cabelos afetados, escamas de pele ou unhas em busca de dermatófitos. Antes da coleta da amostra, a área deve ser desinfetada com álcool 70%.

- Amostra de pele

Em lesões escamosas, a borda da lesão deve ser raspada, pois é mais provável que o fungo seja encontrado ali.

Nas lesões exsudativas, a amostra é coletada com um cotonete seco ou úmido. Semeie imediatamente em ágar batata dextrose ou ágar Sabouraud. Evite meios de transporte.

Outro método de amostragem é através da técnica do tapete quadrado de Mariat e Adan Campos. Neste caso, a área afetada é friccionada 5 vezes com um pedaço de lã esterilizada para posterior cultivo.

A amostra pode ser colocada diretamente no meio de cultura.

- Amostra de cabelo

Dependendo da patologia, a parte afetada pode ser cortada ou arrancada. Coloque a amostra no meio de cultura.

- Amostra de unha

Uma parte específica da unha afetada pode ser raspada ou cortada. Dependerá do tipo de lesão.

Cortar a amostra em pedaços de 1 mm antes da semeadura para aumentar a probabilidade de contato do fungo com o meio de cultura.

Procedimento de identificação

As colônias obtidas na placa são isoladas em tubos contendo ágar batata dextrose, a partir daí para a realização do estudo macroscópico das colônias (aspecto, cor, consistência, grau de desenvolvimento.

O estudo microscópico (observação das estruturas e suas formações) pode ser feito por microculturas ou observação direta ao microscópio entre lâmina e lâmina.

Contagem de colonias

Este meio também pode ser usado para determinar a carga de fungos e leveduras presentes em amostras de plantas, alimentos, cosméticos ou medicamentos. Para tanto, utiliza-se agar batata dextrose suplementado com antibióticos, tais como: (cloranfenicol, clorotetraciclina ou ambos).

Despeje 1 ml da amostra -de preferência diluída- em uma placa de Petri estéril e vazia, derreta um tampão de ágar batata dextrose e deixe esfriar a 45 ° C. Despeje sobre a placa de Petri e gire até homogeneizar. Deixe descansar até que se solidifique.

Incubar aerobicamente a 20-25 ° C (bolores) ou 30-32 ° C (leveduras) por 5 a 7 dias ou mais, dependendo do tipo de fungo que está sendo procurado e do tipo de amostra. Duas placas podem ser usadas para incubar em ambas as faixas de temperatura.

Manutenção de cepas de fungos

O Ágar Dextrose Batata pode ser usado para manter cepas de fungos viáveis por vários anos.

Para fazer isso, o fungo é cultivado em fatias de ágar batata dextrose e, uma vez que o fungo cresceu, é coberto com óleo mineral. O óleo deve ser esterilizado em autoclave por 45 minutos, e ter viscosidade de aproximadamente 300 a 330 Saybolt. O óleo deve estar 1 a 2 cm acima da ponta do bisel.

Controle de qualidade

De cada lote preparado, pegue 1 ou 2 placas e incube-as a 25 ° C por 48 horas ou a 20 ° C por 96 horas. Um bom controle de esterilidade é aquele em que não se observa o desenvolvimento de colônias.

Cepas de controle conhecidas ou certificadas também podem ser usadas, tais como:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. Espera-se um bom crescimento em todos os casos.

Referências

Britannia Laboratories. Agar de batata de glicose. 2015. Disponível em: britanialab.com
Neogen Laboratories. Agar de Dextrose de Batata. Disponível em: foodsafety.neogen.com
Laboratório Insumolab. Agar de dextrose de batata. Disponível em: insumolab.cl
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