Teste de catalase: justificativa, técnica e usos - Ciência - 2023
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Contente
- Base
- Técnica de rotina para teste de catalase
- - Método deslizante
- materiais
- Processo
- Interpretação
- - Método direto em cultura pura
- -Método com tubo capilar ou Fung e Petrishko
- - Método Taylor e Achanzar para testes de catalase que dão questionável
- Teste de catalase para espécies de Mycobacterium
- -Materiais
- -Preparação de reagentes
- Tampão de fosfato pH 7
- 10% Tween 80
- Reagente final
- -Processo
- Usar
- Controle de qualidade
- Limitações
- Referências
o teste de catalase é uma metodologia utilizada em laboratórios de bacteriologia para mostrar a presença da enzima catalase nas bactérias que a possuem. Juntamente com a coloração de Gram, são os principais testes que devem ser realizados em microrganismos recém-isolados. Esses testes orientam o microbiologista sobre os passos a seguir para a identificação definitiva do microrganismo em questão.
Em geral, as bactérias que contêm citocromo possuem a enzima catalase, o que significa que as bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas devem possuí-la. Porém, há exceções, como o Streptococcus, que apesar de ser microorganismo anaeróbio facultativo, não possui a enzima catalase.
É por isso que o teste da catalase é usado principalmente para distinguir as famílias Staphylococaceae e Micrococaceae (ambas catalase positiva) da família Streptococaceae (catalase negativa).
Da mesma forma, o gênero Bacillus (catalase positiva) é diferenciado do gênero Clostridium (catalase negativa), entre outros.
Base
A catalase é uma enzima classificada como hidroperoxidase, ou seja, utiliza peróxido de hidrogênio (H2OU2).
É também considerada uma oxidorredutase, pois na reação em que participa há um elemento que atua como doador de elétrons (substância redutora) e outro como receptor de elétrons (substância oxidante).
A catalase é uma proteína que contém um grupo prosérico com quatro átomos de ferro trivalente (Fe+++), portanto, é uma homoproteína. O íon férrico permanece oxidado durante a reação.
Pode-se dizer que a catalase é uma enzima desintoxicante, pois sua função é eliminar as substâncias produzidas durante o metabolismo bacteriano e que são tóxicas para as bactérias. Entre essas substâncias está o peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio é formado a partir da quebra de açúcares aerobicamente. Este processo ocorre da seguinte forma:
O íon superóxido (O2–) (radical livre) é formado como o produto final da assimilação da glicose pela via aeróbia. Este é tóxico e é eliminado pela enzima superóxido dismutase, que o transforma em oxigênio gasoso e peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio também é tóxico para as bactérias e deve ser removido. A enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.
A catalase pode atuar em outros substratos além do peróxido de hidrogênio, como álcoois, aldeídos, ácidos, aminas aromáticas e fenóis. No entanto, o peróxido de hidrogênio também pode ser usado pela catalase para oxidar outros compostos tóxicos, como o álcool metílico e etílico.
Da mesma forma, a catalase está presente nas células fagocíticas, protegendo-as da ação tóxica do peróxido de hidrogênio.
Técnica de rotina para teste de catalase
- Método deslizante
materiais
3% de peróxido de hidrogênio (10 volumes).
Lâmina de microscópio
Cabo de plástico descartável ou palito de madeira.
Processo
Pegue o suficiente da colônia para estudar sem tocar no ágar de onde veio. A colônia deve ser fresca, ou seja, de uma cultura de 18 a 24 horas.
Coloque a colônia na lâmina seca e adicione uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% (você também pode usar H2OU2 30%). Observe imediatamente se as bolhas são liberadas ou não.
Interpretação
Reação positiva: evolução de gás, evidenciada pela formação de bolhas (forte borbulhamento).
Reação negativa: sem formação de bolhas.
- Método direto em cultura pura
Coloque 1 ml de H2OU2 3% em uma placa pura ou cultura em cunha que não contém sangue (de preferência ágar nutriente). Observe se há ou não formação de bolhas imediatamente. Você também pode usar H2OU2 30%.
É interpretado da mesma forma que o método porta object.
-Método com tubo capilar ou Fung e Petrishko
Preencher um tubo capilar de 67 mm até uma altura de 20 mm com peróxido de hidrogênio 3% por capilaridade.
Toque a colônia isolada a ser estudada com o capilar cheio de H2OU2 às 3%. Observe se o capilar se enche de bolhas em aproximadamente 10 segundos. Este método permite a semiquantificação da reação em cruzamentos:
Sem cruzes não há bolhas (reação negativa).
+ - Poucas bolhas (reação fraca ou retardada).
++ -– Bolhas abundantes (reação moderada).
+++ -As bolhas alcançam o extremo oposto (reação energética).
- Método Taylor e Achanzar para testes de catalase que dão questionável
Em uma lâmina limpa e seca, coloque uma colônia isolada e, em seguida, coloque uma gota de H2OU2 0,5% e cubra com uma lamela. Observe se há formação de bolhas presas ou não.
Interpretação: a presença de bolhas indica uma reação positiva. Sem bolhas, é interpretado como uma reação negativa.
Teste de catalase para espécies de Mycobacterium
Essa técnica precisa ser feita controlando o pH e a temperatura. Deve ser realizado sob uma capela de fluxo laminar, uma vez que a manipulação das diferentes espécies de Mycobacterium é perigosa.
-Materiais
Peróxido de hidrogênio 30% ou 110 volumes (superoxal).
Tampão de fosfato pH 7
10% Tween 80
Cultura de Mycobacterium wedge por 3 a 4 semanas
-Preparação de reagentes
Tampão de fosfato pH 7
Pesar:
1,361 g (KH2PO4) fosfato monopotássico anidro.
1,420 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO3).
Dissolver os dois sais em um pouco de água destilada estéril e perfazer a 1000 ml com água.
10% Tween 80
Faça uma diluição de 1:10 para o Tween 80 que está comercialmente concentrado, para fazer isso, proceda da seguinte forma:
Pegar 1 ml de Tween 80 e colocar em um pouco de água destilada, dissolver e perfazer o volume com água até 10 ml.
Reagente final
Misture uma quantidade de tampão de fosfato com uma quantidade de Tween 80 a 10% (partes iguais). Defina em laboratório o quanto deseja preparar.
-Processo
Coloque 5 ml de tampão fosfato em um tubo de teste estéril com tampa de rosca (baquelite).
Com uma alça de inoculação, pegue colônia suficiente de um crescimento de Mycobacterium semeado em fatias e dissolva no tampão de fosfato.
Tampe o tubo sem apertar demais a rosca. Coloque em banho-maria a 68 ° C por 20 a 30 minutos. Retire e deixe esfriar a 22-25 ° C
Meça 0,5 ml do reagente final (mistura) e adicione ao tubo com a solução fria. Observe a formação ou não de bolhas.
É interpretado da mesma forma que as técnicas anteriores.
Usar
Quando o crescimento da colônia é obtido em meio enriquecido, uma coloração de Gram e um teste de catalase devem ser realizados nas colônias obtidas. Isso orientará o microbiologista sobre os procedimentos a seguir para a identificação definitiva.
Controle de qualidade
Para avaliar o desempenho do reagente de peróxido de hidrogênio, use cepas de controle recém-crescidas, como Staphylococcus aureus como um controle positivo e cepas de Streptococcus sp como um controle negativo.
Outra alternativa que serve como controle positivo é colocar uma gota de peróxido de hidrogênio no ágar sangue, os eritrócitos possuem catalase, portanto, haverá borbulhamento se o reagente estiver em boas condições.
Um ágar chocolate pode ser usado como controle negativo, aqui os eritrócitos já estão lisados e o teste é negativo.
Limitações
-Não use culturas antigas para o teste, pois isso pode causar falsos negativos.
-Evite colher colônias de culturas em ágar sangue, se tiver cuidado para não tocar no ágar; Esse procedimento pode levar a falsos positivos, pois os glóbulos vermelhos contêm catalase.
-Se tirar a colônia com cabo de platina, não inverta a ordem do procedimento, pois isso pode gerar falsos positivos. Isso ocorre porque a platina é capaz de reagir com o peróxido de hidrogênio, causando borbulhamento.
-Não use o reagente de peróxido de hidrogênio se for muito antigo, pois o reagente é muito instável e tende a quebrar com o tempo.
-Mantenha o reagente de peróxido de hidrogênio protegido da luz e refrigerado para evitar danos.
- Efetue um controle de qualidade do reagente de peróxido de hidrogênio cada vez que for usado.
-Leve em consideração que se o H2OU2 a 30% as reações são mais fortes do que aquelas realizadas com H2OU2 às 3%.
Referências
- Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.
- Laboratórios BD. Reagente Catalase-Gotario. Disponível em: http://winklerltda.cl
- Laboratórios Vadequímica. Água oxigenada. Equivalência entre volumes e porcentagem. Disponível em: vadequimica.com