Coloração de Gram: usos, características e tipos - Médico - 2023

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Quando sofremos uma infecção bacteriana, é essencial saber com que tipo de bactéria estamos lidando. E é a partir disso que terão que administrar alguns antibióticos ou outros. Mas como sabemos o que é? Olhando pelo microscópio? Eu gostaria que fosse assim tão simples.

Ao obtermos uma amostra de algum tecido, a priori, infectado e prepará-lo para visualização ao microscópio, se não fizermos alguns tratamentos anteriores, não veremos absolutamente nada. Na microbiologia do dia-a-dia, as preparações devem ser coradas.

Isso significa que sobre a amostra devemos aplicar um corante que torne a bactéria visível, que revele sua forma e tamanho, que permita identificar as estruturas internas e externas dessas células e, principalmente, que ela se comporte (reage ) de forma diferente, dependendo da espécie bacteriana em questão.

E, nesse sentido, a coloração de Gram é talvez a mais famosa e útil do mundo.. Essa técnica é básica para a avaliação inicial de amostras bacterianas, pois dependendo de como o corante atua e da cor que adota ao entrar em contato com a bactéria, permitirá estabelecer dois grupos principais: gram positivos ou gram negativos. Esta é a primeira etapa da identificação, pois cada um desses grupos é sensível a certos antibióticos. No artigo de hoje, explicaremos em que consiste a coloração de Gram, como ela é realizada e para que serve.

Qual a importância das manchas?

Não é que as manchas sejam importantes, é que são essenciais. No ambiente clínico, os microscópios são as ferramentas mais úteis para identificar espécies de patógenos. São ferramentas muito precisas que permitem que uma amostra seja amplificada 1.400 vezes, mas mesmo assim não basta saber com que bactéria estamos enfrentando.

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Não importa o quão poderoso seja o microscópio e não importa o quão experiente o cientista seja, olhar para uma amostra “simplesmente” não será capaz de identificar a espécie bacteriana em questão. Então o que fazemos? Analisar geneticamente a bactéria? Isso seria uma perda total de tempo.

A realidade da prática clínica em microbiologia é que a ferramenta por excelência para identificar espécies bacterianas são as manchas, que consistem em técnicas diagnósticas em que um corante é aplicado na amostra para que ela revele informações importantes sobre o grupo bacteriano antes daquele que encontramos.

Nesse campo, entendemos por corante qualquer substância química que, em contato com o tecido vivo, é capaz de dar cor às células. E é que embora os microrganismos possam ser observados diretamente no microscópio, se quisermos identificar o que é, teremos que aplicar um corante por cima deles.

E dependendo do corante utilizado, estaremos enfrentando um tipo de coloração ou outro. Se uma única coloração for usada e a amostra for tingida da mesma cor, será uma única coloração. Se a cor for obtida graças a uma molécula fluorescente ligada a um anticorpo que se liga especificamente a uma estrutura celular específica que queremos visualizar, seremos confrontados com uma coloração específica. E, finalmente, se mais de um corante for usado e células de cores diferentes forem visualizadas, será uma coloração diferencial. E este último é o que nos interessa, já que a coloração de Gram pertence a este grupo.

Então, o que é a coloração de Gram?

Desenvolvida em 1884 pelo cientista dinamarquês Hans Christian Gram, essa técnica de diagnóstico continua a ser usada universalmente na rotina diária de praticamente todos os laboratórios de análises microbiológicas do mundo. É eficaz, simples de executar, rápido e económico.

A coloração de Gram é um tipo de coloração diferencial em que são usados dois corantes e que permite que as bactérias sejam separadas em dois grandes grupos: gram positivas e gram negativas. Na verdade, essa diferenciação é a base da bacteriologia. E é que dependendo do tipo da bactéria, o tratamento necessário para combatê-la será uma ou outra. Não é necessário saber exatamente o que é bactéria. Contanto que saibamos se é gram positivo ou negativo, geralmente temos o suficiente.

Portanto, a coloração de Gram é uma técnica diagnóstica preliminar que consiste no primeiro passo para identificar a etiologia de uma doença, ou seja, saber qual patógeno é a causa dela.

Então, quando isso é feito? Você pode não ter ouvido falar, mas se alguma vez ficou doente e mandou colher amostras para descobrir quais bactérias o infectaram, eles certamente fizeram esse tipo de coloração com a amostra. E é que a coloração de Gram é usada em todas as situações de hospitais, clínicas ou centros de pesquisa em que uma primeira abordagem à natureza de uma infecção bacteriana deve ser feita.

Infecções de urina, pneumonia, meningite, sepse, doenças intestinais, doenças sexualmente transmissíveis, infecções cardíacas, úlceras de pele infectadas ... A coloração de Gram pode ser realizada em qualquer amostra de tecido vivo em que a bactéria possa estar presente.

Depois de fazer isso, os cientistas e médicos já podem ter tudo de que precisam para direcionar o tratamento de forma adequada. Também há momentos em que exames complementares de diagnóstico devem ser realizados, mas ainda assim a coloração de Gram continua sendo a base.

Mas por que algumas bactérias se coram de uma maneira específica e outras de uma maneira diferente? Mais tarde, discutiremos o que determina se uma bactéria é gram positiva ou gram negativa, mas primeiro vamos ver como essa técnica é realizada.

Como a coloração de Gram é realizada?

A primeira parte é coletar a amostra, que deve ser líquida ou, no mínimo, viscosa, portanto, se o tecido for sólido, deve-se passar por algum processamento prévio para diluí-lo em uma solução líquida. De qualquer forma, a amostra deve ser espalhada em uma lâmina de vidro. Neste ponto, devemos deixar a amostra secar no próprio ar. Como vai ficar muito bom, vai demorar um pouco para fazer.

Depois de seco, ou seja, quando não houver mais água, aplicamos metanol na lâmina, diretamente sobre a amostra. Este composto químico é um álcool, portanto, se as bactérias estivessem vivas, morreriam instantaneamente. Isso não é um problema, pois eles podem ser perfeitamente visualizados como mortos. Esta etapa é essencial, pois assim eles grudam na superfície do slide e não os perderemos nas etapas seguintes.

Agora é a hora de adicionar a primeira mancha (lembre-se de que, sendo uma mancha diferencial, são usadas duas), que é a violeta de genciana, também conhecida como violeta de cristal. Esta primeira mancha irá manchar todas as bactérias de roxo, depois de deixá-la agir por alguns minutos. Um composto conhecido como lugol também é adicionado, o que serve para evitar que o corante escape das células em que entrou.

Após este tempo, a amostra é lavada para remover o excesso de corante e uma mistura de álcool e acetona é adicionada. Este é o ponto-chave, pois este produto químico irá desbotar as bactérias que não absorveram o primeiro corante. Em pouco tempo, para evitar o desbotamento de todos, o álcool-acetona deve ser retirado com água. Neste ponto já podemos visualizar os gram positivos (se houver).

Mas faltam gram negativos. E aqui o segundo corante entra em ação: safranina ou fucsina. Com esta etapa, conseguimos que as bactérias que perderam o primeiro corante (roxo) ficam manchadas de rosa ou vermelho. Agora temos os gram negativos (se houver).

Agora o cientista pode levar a amostra para o laboratório e vai observar as células roxas (ou azuis escuras), que são as que aprisionaram o primeiro corante e que representam as células gram positivas; e células avermelhadas, que são aquelas que perderam o primeiro corante e aprisionaram o segundo, e que representam os gram-positivos.

O mais comum é que haja apenas um tipo na amostra, ou seja, todos são gram positivos ou gram negativos. Dessa forma, o microbiologista já pode ter uma primeira aproximação de que tipo de bactéria causou a infecção.

Gram positivos e gram negativos: quem é quem?

Temos falado sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas ao longo do artigo, mas por que elas tingem cores diferentes? Por que essa classificação é tão importante? Qual a diferença entre eles? Por que cada um é sensível a certos antibióticos? Agora vamos responder a tudo isso.

Mas para entender por que cada um tinge de uma cor diferente, devemos entender a natureza de sua parede celular e membrana. É aí que está a chave de tudo. Porque a cobertura de bactérias pode adotar basicamente duas conformações.E dependendo de como for, vai reagir de maneira específica aos corantes.

Sem entrar muito na estrutura e anatomia microbiana, o importante a se ter em mente é que a maneira como a bactéria se cora depende das propriedades de sua parede. As bactérias Gram positivas possuem uma única membrana celular e, acima dela, uma parede espessa composta por peptidoglicano.

Os gram negativos, por outro lado, possuem uma membrana celular interna, acima desta uma parede muito fina de peptidoglicano (nada a ver com a espessura da parede dos gram positivos) e, acima desta, uma segunda membrana celular, que é conhecido como membrana externa.

Toda a coloração de Gram é baseada em um único princípio fundamental: o primeiro corante (violeta de genciana ou violeta de cristal) tem uma alta afinidade para o peptidoglicano de parede bacteriana. Agora, então, parece óbvio o que acontece.

Os Gram positivos, por terem muito mais peptidoglicanos em suas paredes, retêm esse primeiro corante com muita facilidade. Os gram negativos (aos quais, aliás, destruímos a membrana externa ao aplicar a mistura de álcool e acetona), por outro lado, por ter muito pouco peptidoglicano, não conseguem retê-lo. Assim, quando lavamos a amostra, o primeiro corante fica retido nos gram positivos, mas os negativos o perdem e, portanto, desbotam. No momento, apenas os positivos são tingidos com essa cor roxa ou azul escura.

Por fim, é colocado o segundo corante (safranina), que não tem mais afinidade pelo peptidoglicano e, portanto, pode se ligar sem problemas às células que permanecem sem coloração, que são gram negativas. Essas bactérias aparecerão de cor vermelha a rosa.

E como os antibióticos funcionam ou não, dependendo de como a parede também está, Ao saber se é positivo ou negativo, saberemos quais antibióticos podem funcionar e quais não. Essa é a grande utilidade da técnica. Gram-positivos são sensíveis a alguns antibióticos e resistentes a outros. E os gram negativos, o mesmo.

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As bactérias Gram negativas têm espécies como "Neisseria meningitidis" (causando meningite), "Escherichia coli" (causando gastroenterite) ou "Salmonella enterica" (causando gastroenterite).

Dos gram-positivos, temos representantes como "Bacillus anthracis" (responsável pelo antraz), "Clostridium botulinum" (causando botulismo), "Staphylococcus aureus" (causando infecções de pele ou gastroenterite) ou "Streptococcus faecalis" (responsável por infecções urinárias) .

Em resumo, a coloração de Gram, apesar de suas limitações óbvias, como não conseguir visualizar bactérias que não possuem parede celular (são poucas, mas existem), nem bactérias com composição química muito diferente das demais, nem , evidentemente, vírus; É uma técnica essencial na prática clínica para fazer uma primeira aproximação de qual patógeno pode ser a causa de uma doença.

Referências bibliográficas

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