Esfera de Agar Padrão: Justificativa, Preparação e Usos - Ciência - 2023

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Padrão de esferas de ágar: justificativa, preparação e usos - Ciência
Padrão de esferas de ágar: justificativa, preparação e usos - Ciência

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o contagem padrão de ágar é um meio de cultura sólido, não seletivo, destinado à quantificação da carga microbiana aeróbia presente em amostras de água potável, efluente, bebidas lácteas, entre outros alimentos. Este meio também é conhecido como ágar PCA, por sua sigla em Inglês Plate Count Agar. Foi criado em 1953 por Buchbinder, Baris e Goldstein.

O meio de ágar de contagem padrão é composto de extrato de levedura, tripteína, glicose, ágar e água destilada. Esta formulação contém elementos nutricionais básicos que permitem o desenvolvimento da carga microbiana aeróbia presente, não exigente.

Como o meio não contém inibidores, as bactérias podem crescer sem quaisquer restrições, tornando-o ideal para a contagem geral de colônias. No entanto, a técnica de quantificação de placa não detectará todas as bactérias presentes, mas apenas aquelas que são capazes de crescer nas condições ambientais às quais o ágar de contagem padrão semeado é submetido.


Nesse sentido, a técnica de quantificação em placa geralmente busca determinar a quantidade de bactérias do tipo aeróbio mesofílico, ou seja, aquelas que se desenvolvem em temperaturas entre 25 e 40 ° C, com temperatura ótima de crescimento de 37 ° C. .

Este grupo bacteriano é muito importante, porque a maioria das bactérias patogênicas para o homem se encontra ali.

Deve-se notar que às vezes pode ser interessante quantificar a quantidade de bactérias psicrofílicas presentes nos alimentos. Estas bactérias são aquelas que se desenvolvem a baixas temperaturas (<20 ° C) e são responsáveis ​​pela rápida decomposição dos alimentos, mesmo quando estão no frigorífico.

Da mesma forma, as bactérias termofílicas, que se desenvolvem em uma faixa de 50 ° C a 80 ° C ou mais, podem ser importantes em certos tipos de alimentos, como alimentos enlatados.

A quantificação microbiana é expressa em unidades formadoras de colônias (CFU) por grama ou mililitro de amostra.

Base

O meio de contagem padrão é projetado para permitir o crescimento bem-sucedido de bactérias aeróbicas não fastidiosas, pois o extrato de levedura, a tripteína e a glicose fornecem os nutrientes necessários para o crescimento microbiano adequado.


Por outro lado, o meio apresenta uma cor clara e um aspecto transparente, por isso é ideal para a visualização de colônias desenvolvidas pelo método de semeadura em profundidade (despejo em prato).

A contagem de colônias pelo método de semeadura superficial da espátula Drigalski também é possível.

Quando a carga microbiana é alta, devem ser feitas diluições decimais da amostra em estudo para a contagem das UFC.

Ressalta-se que este meio é recomendado pela American Public Health Association (APHA) para a contagem de mesófilos aeróbios.

Preparação

Pesar 23,5 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Para dissolver completamente, a mistura deve ser aquecida mexendo sempre até ferver. As etapas subsequentes dependem da técnica de semeadura a ser usada.

Para a técnica de vazamento de pratos

Distribua dispensando 12 a 15 ml em tubos de ensaio. Posteriormente, esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixe solidificar verticalmente na forma de um bloco. Guarde na geladeira até o uso.


Derreta o plugue quando for usá-lo. Uma vez derretido, mantenha-o em banho-maria a 44-47 ° C enquanto as amostras são preparadas.

Para semeadura superficial

Esterilize o meio em autoclave a 121 ° C e distribua 20 ml em placas de Petri estéreis. Deixe solidificar, inverta e guarde na geladeira até o uso.

Tempere as placas antes de usar. O pH do meio deve ser 7,0 ± 0,2.

Usar

O Ágar de Contagem Padrão é usado na técnica de contagem de mesófilos aeróbicos durante a análise microbiológica de água e alimentos. A contagem de mesófilos aeróbios é necessária, pois determina a qualidade sanitária da amostra em estudo.

A aplicação desta técnica (neste meio) permite a visualização macroscópica de colônias isoladas para sua quantificação.

Técnica de derramamento de placa (semeadura em profundidade)

-Processo

A técnica consiste no seguinte:

1) Homogeneizar a amostra para redistribuir as bactérias presentes.

2) Uma suspensão inicial é feita em frasco ou bolsa estéril, respeitando a proporção de 10 gr ou 10 ml de amostra em 90 ml de diluente (10-1).

3) A partir da suspensão inicial, as diluições decimais pertinentes são feitas dependendo do tipo de amostra. Ex: (10-2, 10-3, 10-4) As diluições são feitas com água peptonada ou tampão fosfato.

Para isso, pegue 1 ml da suspensão inicial e coloque em 9 ml de diluente, continue as diluições se necessário, tomando agora 1 ml da diluição 10-2 e assim por diante.

4) Pegue 1 ml de cada diluição e coloque em placas de Petri estéreis vazias.

5) Adicione a cada placa 12 a 15 ml de ágar de contagem padrão previamente derretido e sedimentado a 44 - 47 ° C.

6) Agite suavemente as placas para distribuir a amostra uniformemente ao longo do ágar e permitir que solidifique.

7) Inverter as placas e incubar a 37 ° C em aerobiose por 24 a 48 horas.

8) Ao final do tempo, as placas são examinadas e as colônias são contadas na diluição que o permitir. As placas que possuem entre 30 e 300 CFU são escolhidas para a contagem.

A contagem pode ser feita manualmente ou você pode usar o equipamento contador de colônias.

Os valores permitidos por ml de amostra podem variar de um país para outro dependendo dos regulamentos que os regem.

-Cálculo do UFC

O cálculo geral é feito usando a seguinte fórmula:

Expresse os resultados em 1 ou 2 dígitos, multiplicando pela base 10 apropriada. Exemplo: se o resultado for 16.545, ele será arredondado com base no terceiro dígito para 17.000 e será expresso da seguinte forma: 1,7 x 104. Agora, se o resultado fosse 16.436, arredonde para 16.000 e expresse 1,6 x 104.

Técnica de semeadura de superfície

-Processo

-Inocular com 0,1 ml da amostra direta se for líquida, suspensão inicial 10-1 ou 10 diluições consecutivas-2, 10-3 etc, no centro de uma placa de ágar de contagem padrão.

- Distribuir a amostra sempre com uma espátula Drigalski ou com uma vareta de vidro em forma de L. Deixar repousar 10 minutos.

-Inverter as placas e incubar aerobicamente a 37 ° C por 24 a 48 horas.

- Continue a contar as colônias, escolha as placas que estão no intervalo entre 20 - 250 UFC.

-Cálculo do UFC

Para o cálculo, é aplicado o fator de diluição, que é o inverso. O número é arredondado para 2 dígitos significativos (arredondamento de acordo com o terceiro dígito) e expresso em potência de base 10. Por exemplo, se 224 CFU forem contados na amostra sem diluição (10-1), 22 x 10 é relatado1 UFC, mas se o número fosse 225, é relatado 23 x 101 UFC.

Agora, se você contar 199 CFU na diluição 10-3, ele reportará 20 x 104 CFU, mas se 153 CFU forem contados na mesma diluição, 15 x 10 serão relatados4 UFC.

Controle de qualidade

O meio de cultura de contagem padrão pode ser avaliado usando cepas conhecidas certificadas, como: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Se o meio de cultura estiver em condições ideais, o crescimento satisfatório é esperado em todos os casos, exceto para L. fermentum que pode ter um desempenho regular.

Para avaliar a esterilidade do meio de cultura, uma ou duas placas de cada lote preparado (sem inoculação) devem ser incubadas a 37 ° C em aerobiose por 24 horas. Após este tempo, nenhum crescimento ou mudança de cor do meio deve ser observado.

Limitações

-Não derreta o ágar mais de uma vez.

-O meio preparado pode durar até 3 meses, desde que guardado no frigorífico e protegido da luz.

-Este meio não é adequado para microrganismos exigentes ou anaeróbicos.

Referências

  1. Administração Nacional de Medicamentos, Alimentos e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microrganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: anmat.gov.ar
  2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, S.A. Plate Count Agar. 2009. Disponível em: http://f-soria.es
  3. Laboratórios Conda Pronadisa. APHA e ISO 4833 Standard Method Agar (PCA) Disponível em: condalab.com
  4. Britannia Laboratories. Contagem de placas de ágar. 2015. Disponível em: britanialab.com
  5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B e Velázquez O. 2009. Técnicas de Análise Microbiológica de Alimentos. 2ª ed. Faculdade de Química da UNAM. México. Disponível em: depa.fquim.unam