Microarrays de DNA: procedimento e aplicações - Ciência - 2023

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UMA Microarray de DNA, também chamado de chip de DNA ou microarray de DNA, é composto de uma série de fragmentos de DNA ancorados a um suporte físico de material variável, seja plástico ou vidro. Cada pedaço de DNA representa uma sequência complementar a um gene específico.

O objetivo principal dos microarrays é o estudo comparativo da expressão de determinados genes de interesse. Por exemplo, é comum que essa técnica seja aplicada a duas amostras - uma saudável e outra patológica - para identificar quais genes estão sendo expressos e quais não estão na amostra com a doença. A referida amostra pode ser uma célula ou um tecido.

Geralmente, a expressão gênica pode ser detectada e quantificada graças ao uso de moléculas fluorescentes. A manipulação dos chips é realizada na maioria dos casos por robôs e um grande número de genes podem ser analisados simultaneamente.

Esta nova tecnologia é útil para uma ampla gama de disciplinas, desde diagnósticos médicos a vários estudos de biologia molecular nas áreas de proteômica e genômica.

Em que consiste?

Microarrays de DNA (ácido desoxirribonucléico) são um conjunto de segmentos de DNA específicos anexados a uma matriz sólida. Essas sequências são complementares aos genes que se pretendem estudar e podem ter até 10.000 genes por cm².

Essas características permitem o estudo sistemático e massivo da expressão gênica de um organismo.

A informação de que uma célula necessita para funcionar é codificada em unidades chamadas “genes”. Certos genes contêm as instruções para criar moléculas biológicas essenciais chamadas proteínas.

Um gene é expresso se seu DNA é transcrito em uma molécula intermediária de RNA mensageiro e a expressão do gene pode variar dependendo do nível de transcrição desse segmento de DNA. Em certos casos, a mudança na expressão pode ser indicativa de doenças.

O princípio da hibridização torna possível a operação de microarrays. O DNA é uma molécula composta por quatro tipos de nucleotídeos: adenina, timina, guanina e citosina.

Para formar a estrutura de dupla hélice, a adenina é agrupada com timina e a citosina com guanina. Assim, duas cadeias complementares podem ser unidas por ligações de hidrogênio.

Tipos de microarrays

Em termos de estrutura dos microarranjos, existem duas variações: o DNA complementar personalizado ou oligonucleotídeos, e os microarranjos comerciais de alta densidade fabricados por empresas comerciais, como a Affymetrix GeneChip.

O primeiro tipo de microarray permite a análise de RNA de duas amostras diferentes em um único chip, enquanto a segunda variação é do tipo comercial e possui um grande número de genes (por exemplo, o Affymetrix GeneChip possui cerca de 12.000 genes humanos) permitindo analisar uma única amostra.

Processo

Isolamento de RNA

O primeiro passo na condução de um experimento usando a tecnologia de microarray é o isolamento e purificação das moléculas de RNA (pode ser RNA mensageiro ou outros tipos de RNA).

Se você deseja comparar duas amostras (saudável x doente, controle x tratamento, entre outras), deve-se fazer o isolamento da molécula em ambos os tecidos.

Produção e rotulagem de cDNA

Posteriormente, o RNA é submetido a um processo de transcrição reversa na presença de nucleotídeos marcados e, assim, o DNA complementar ou cDNA será obtido.

A marcação pode ser fluorescente e deve ser distinguível entre os dois tecidos a serem analisados. Os compostos fluorescentes Cy3 e Cy5 são tradicionalmente usados, uma vez que fluorescem em diferentes comprimentos de onda. No caso de Cy3, é uma cor próxima do vermelho e Cy5 corresponde ao espectro entre laranja e amarelo.

Hibridização

Os cDNAs são misturados e incubados no microarray de DNA para permitir a hibridização (isto é, ocorre a ligação) do cDNA de ambas as amostras com a porção de DNA imobilizada na superfície sólida do microarray.

Uma maior porcentagem de hibridização com a sonda no microarray é interpretada como uma maior expressão no tecido do mRNA correspondente.

Leitura do sistema

A quantificação da expressão é realizada por meio da incorporação de um sistema leitor que atribui um código de cor à quantidade de fluorescência emitida por cada cDNA. Por exemplo, se o vermelho for usado para marcar a condição patológica e se hibridizar em maior extensão, o componente vermelho será o predominante.

Com esse sistema, a superexpressão ou repressão de cada gene analisado nas duas condições selecionadas pode ser conhecida. Em outras palavras, o transcriptoma das amostras avaliadas no experimento pode ser conhecido.

Formulários

Atualmente, os microarrays são considerados ferramentas muito poderosas na área médica. Esta nova tecnologia permite o diagnóstico de doenças e um melhor entendimento de como a expressão gênica é modificada em diferentes condições médicas.

Além disso, permite a comparação de um tecido controle e um tecido tratado com determinado medicamento, a fim de estudar os efeitos de um possível tratamento médico.

Para fazer isso, o estado normal e o estado de saúde são comparados antes e depois da administração do medicamento. Ao estudar o efeito da droga no genoma na Vivo você tem uma visão geral melhor do mecanismo de ação dele. Além disso, pode-se entender por que alguns medicamentos específicos levam a efeitos colaterais indesejados.

Câncer

O câncer está no topo da lista de doenças estudadas com microarrays de DNA. Essa metodologia tem sido utilizada para classificação e prognóstico da doença, principalmente nos casos de leucemia.

O campo de pesquisa dessa condição envolve a compressão e caracterização das bases moleculares das células cancerosas para encontrar padrões de expressão gênica que resultem em falhas na regulação do ciclo celular e nos processos de morte celular (ou apoptose).

Outras doenças

Por meio do uso de microarrays, foi possível elucidar os perfis de expressão diferencial de genes em condições médicas de alergias, imunodeficiências primárias, doenças autoimunes (como artrite reumatóide) e doenças infecciosas.

Referências

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