Caldo de tioglicolato: justificativa, preparação e usos - Ciência - 2023

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o caldo de tioglicolato É um meio de cultura enriquecido com uma consistência fluida. É conhecido pela sigla FTM por sua sigla em Inglês Fluid Thioglycollate Medium. Foi criado por Brewer e modificado em 1944 por Vera, que adicionou peptona de caseína a ele.

Este meio tem um baixo potencial de oxidação-redução, portanto não é recomendado para o desenvolvimento de bactérias aeróbias estritas, mas é ideal para recuperar bactérias aeróbias facultativas, anaeróbias estritas e microaerofílicas pouco exigentes.

O alto desempenho observado com este meio no isolamento e recuperação de uma ampla variedade de microrganismos, fez com que fosse aceito pela Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), pela Official Association of Agricultural Chemists (AOAC) e pela European Pharmacopoeia ( EP).

Essas organizações o recomendam para testes de controle de esterilidade de produtos farmacêuticos e para enriquecimento de vários tipos de amostras.

Cada tioglicolato é composto de extrato de levedura, digestão pancreática de caseína, dextrose anidra, L-cistina, cloreto de sódio, tioglicolato de sódio, resazurina e ágar em pequenas quantidades.

Existem várias versões deste meio, entre elas estão: caldo tioglicolato com indicador, caldo tioglicolato sem indicador, caldo tioglicolato com indicador enriquecido com hemina e vitamina K_1,e caldo tioglicolato de carbonato de cálcio.

Notavelmente, a variante de caldo de tioglicolato enriquecida com hemina e vitamina K serve para aumentar o crescimento de anaeróbios fastidiosos, e a variante de caldo de tioglicolato contendo carbonato de cálcio é útil para neutralizar os ácidos produzidos durante o crescimento microbiano.

Base

O caldo de tioglicolato é considerado um meio de enriquecimento não seletivo, pois permite o crescimento da maioria das bactérias não fastidiosas. As necessidades nutricionais são fornecidas pelo extrato de levedura, a digestão pancreática e a glicose.

Por outro lado, este meio, apesar de ser um caldo, contém uma pequena quantidade de ágar; Isso significa que tem baixo potencial de oxidação-redução, pelo fato de retardar a entrada de oxigênio, de forma que o oxigênio diminui à medida que penetra mais fundo no tubo.

Por isso, este meio é ideal para o desenvolvimento de bactérias aeróbias facultativas, microaerofílicas e anaeróbias estritas, estas 2 últimas sem a necessidade de incubação nessas condições. O mesmo meio regula a quantidade de oxigênio dentro do meio, estando ausente no fundo do tubo e em quantidade suficiente na superfície.

Da mesma forma, o tioglicolato e a L-cistina atuam como agentes redutores, contribuindo para a prevenção do acúmulo de substâncias prejudiciais ao desenvolvimento bacteriano, como o peróxido. Além disso, esses compostos contêm grupos sulfidrila (-SH-), neutralizando os efeitos inibitórios de derivados de mercúrio, arsênicos, entre outros metais pesados.

Por sua vez, a resazurina é um indicador de redução do óxido. Esta substância é incolor quando reduzida e rosa quando oxidada. Existem variantes de caldo tioglicolato indicadoras e não indicadoras. Seu uso dependerá do tipo de amostra e da preferência do laboratório.

Enquanto isso, o cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico do caldo de tioglicolato e o uso de glicose na forma anidra evita o excesso de umidade no meio desidratado.

Preparação

Caldo de tioglicolato com indicador

Pesar 29,75 g do meio desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. A mistura é deixada em repouso por aproximadamente 5 minutos. Leve para uma fonte de calor e mexa freqüentemente até dissolver completamente.

Despeje o meio em tubos de ensaio e autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixe esfriar antes de usar. Verifique o encarte da casa comercial para sua conservação. Alguns recomendam o armazenamento em temperatura ambiente em um local escuro, e outros em uma geladeira protegida da luz.

O pH do meio preparado é 7,1 ± 0,2.

A cor do meio desidratado é bege claro e o meio preparado é âmbar claro com alguma opalescência.

Caldo de tioglicolato com indicador enriquecido com hemina e vitamina K₁

Existem meios comerciais que já trazem hemina e vitamina K₁, especialmente para o cultivo de anaeróbios.

Se o meio anaeróbico enriquecido não estiver disponível, o caldo de tioglicolato básico pode ser preparado. Para isso, são adicionados 10 mg de cloridrato de hemina e 1 mg de vitamina K.₁ para cada litro de meio. No entanto, se sangue ou soro forem adicionados ao caldo de tioglicolato, a adição de hemina ou vitamina K não é necessária.

Caldo de tioglicolato com carbonato de cálcio

É comercializado e preparado seguindo as instruções do folheto.

Caldo de tioglicolato sem indicador

Tem a mesma composição do tioglicolato básico, mas não contém resazurina.

Pesar 30 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. O restante da preparação é igual ao descrito para o caldo indicador tioglicolato.

Usar

O caldo de tioglicolato é útil para o enriquecimento de amostras clínicas, especialmente aquelas provenientes de locais estéreis. Também é útil para amostras não clínicas, como cosméticos, medicamentos, etc.

Para a inoculação de amostras líquidas (como LCR, líquido sinovial, entre outras), as amostras são primeiramente centrifugadas e, em seguida, 2 gotas do sedimento são retiradas e colocadas no caldo tioglicolato. Incubar a 35 ° C por 24 horas. Se neste tempo não houver crescimento (turvação), é incubado até no máximo 7 dias.

Se a amostra for coletada com um swab, os meios de cultura são primeiro inoculados em placas e, por fim, o swab é introduzido no caldo, a parte saliente é dividida e o tubo é tampado, deixando o swab dentro. Incubar a 35 ° C por 24 horas, 7 dias no máximo.

Para amostras sólidas, homogeneizar em solução salina fisiológica (SSF) e a seguir inocular o caldo tioglicolato com 2 gotas da suspensão.

Às vezes, pode ser usado como meio de transporte para amostras em que se suspeita da presença de anaeróbios rigorosos ou como caldo de enriquecimento de reserva.

A variante do caldo tioglicolato com carbonato de cálcio é utilizada para a manutenção de cepas controle por mais tempo, pois tem a capacidade de neutralizar os ácidos produzidos pelo uso da glicose; esses ácidos são tóxicos para certas bactérias.

O crescimento no caldo tioglicolato será observado pela turbidez do meio. Recomenda-se a realização da coloração de Gram e posterior subcultura em meio não seletivo e seletivo, dependendo do tipo de amostra e dos microrganismos suspeitos.

Controle de qualidade

Para controle de esterilidade, recomenda-se incubar um ou dois caldos sem inoculação. O resultado esperado é um caldo límpido, sem alteração de cor, embora seja normal ver uma leve coloração rosa na superfície do tubo.

Para controle de qualidade, entre 10 - 100 CFU de cepas de controle certificadas devem ser inoculadas, comoStaphylococcus aureus ATCC 6538, Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Clostridium sporogenes ATCC 11437, Bacteroides vulgatus ATCC 8482.

Incubar a 30-35 ° C em aerobiose por 24 horas até um máximo de 3 dias, visto que esses microrganismos apresentam crescimento rápido.

Bom desenvolvimento é esperado em todos os casos, exceto para Micrococcus luteus Y Bacillus subtilis, onde pode haver desenvolvimento moderado.

Para controle de qualidade do caldo tioglicolato enriquecido com hemina e vitamina K₁, cepas de controle podem ser usadas Bacteroides vulgatus ATCC 8482,Clostridium perfringens ATCC 13124 eBacteroides fragilis ATCC 25285. O resultado esperado é um crescimento satisfatório.

recomendações

- Ocasionalmente, pode-se observar que a superfície do caldo tioglicolato com indicador fica rosa; Isso se deve à oxidação do meio. Se a cor rosa cobrir 30% ou mais do caldo total, ele pode ser aquecido em banho-maria por 5 minutos, resfriado novamente e usado.

Isso removerá o oxigênio absorvido, retornando o meio à sua cor original. Este procedimento só pode ser feito uma vez.

-Para melhorar o crescimento de bactérias aeróbicas, incube com a tampa ligeiramente solta. No entanto, é preferível usar para este fim um caldo de infusão de cérebro e coração ou caldo de tripticase de soja para o desenvolvimento adequado de aeróbios estritos.

-O congelamento ou superaquecimento do meio deve ser evitado, pois ambas as condições prejudicam o meio.

- A luz direta danifica o meio de cultura, deve ser armazenado ao abrigo da luz.

Referências

Britannia Laboratories. Tioglicolato USP com indicador. 2015. Disponível em: labBritania.com.
Chios Sas Laboratories. 2019. Caldo de tioglicolato. Disponível em: quios.com.co
Laboratórios de meio de tioglicolato de fluido BD (FTM). 2003. Disponível em: bd.com/Europe
Meio BBL preparado em tubos para cultivo de microrganismos anaeróbios. Meio tioglicolato. 2013. Disponível em: bd.com
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.