Teste de oxidase: justificativa, procedimento e usos - Ciência - 2023

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o teste de oxidase É um método diagnóstico que mostra a presença do complexo enzimático denominado citocromo oxidase c. Este sistema induz a transformação do citocromo reduzido em oxidado, uma vez que captura o oxigênio e este por sua vez atua como último aceptor de elétrons (H+) na cadeia respiratória.

O termo oxidase é uma forma abreviada de se referir à enzima citocromo oxidase, também conhecida como indofenol oxidase. Antigamente, acreditava-se que as enzimas citocromo oxidase e indofenol oxidase eram duas enzimas diferentes, mas hoje se sabe que são as mesmas.

Já os citocromos são hemoproteínas que contêm ferro e completam o sistema da citocromo oxidase. Os citocromos podem variar de espécie para espécie.

Existem diferentes variedades de citocromos (citocromos a1, a2, a3 e 0). Algumas bactérias podem produzir apenas uma, mas outras até duas ou três de cada vez. Nesse sentido, a presença do citocromo ae a3 é conhecida como citocromo oxidase c. Este é o tipo de citocromo que o teste de oxidase detecta.


Os gêneros Neisseria e Pseudomonas contêm citocromo oxidase c. Esses gêneros apresentam um teste de oxidase positivo, ajudando a diferenciá-los dos gêneros Acinetobacter e Stenotrophomonas, respectivamente.

Existem também outros gêneros que são positivos para oxidase.

Base

Características do sistema citocromo oxidase c

O sistema da citocromo oxidase c funciona da seguinte maneira: microorganismos positivos para oxidase usam oxigênio para gerar energia por meio da respiração aeróbia. Este sistema funciona graças ao transporte de elétrons de substâncias doadoras como o NADH+ para substâncias receptoras, neste caso oxigênio.

Isso resulta na produção de energia (ATP) e água ou peróxido de hidrogênio, dependendo do sistema da citocromo oxidase que o microorganismo possui.

Por isso, grande parte das bactérias oxidase positivas também são catalase positivas, condição necessária para eliminar o peróxido de hidrogênio produzido, uma vez que essa substância é tóxica para as bactérias.


O sistema da citocromo oxidase c está presente em algumas bactérias aeróbias, algumas anaeróbias facultativas, poucas microaerofílicas e nenhum anaeróbio estrito. O último é compreensível, uma vez que anaeróbios estritos não podem viver na presença de oxigênio, portanto, eles não possuem o sistema da citocromo oxidase.

Princípio de teste

Nesse teste, ele usa substâncias que agem como aceptores artificiais de elétrons, substituindo os naturais na cadeia de transporte de elétrons.

Principalmente, são utilizados corantes como a parafenilenodiamina e o indofenol, que atuam como substratos receptores e doadores artificiais de elétrons.

A parafenilenodiamina é oxidada pelo sistema citocromo oxidase c. O corante em sua forma reduzida é incolor, mas em sua forma oxidada é colorido.

É assim que se evidencia a presença do sistema citocromo oxidase c; uma vez que uma reação positiva irá gerar uma cor lilás ou azul-púrpura dependendo do reagente usado.


Por outro lado, se a última substância aceitadora de elétrons da cadeia respiratória for diferente do oxigênio, o teste da oxidase será negativo (não há produção de cor); este é o caso dos microrganismos anaeróbios.

Da mesma forma, se o citocromo utilizado pelo microrganismo for diferente da citocromo oxidase c, também dará o teste negativo.

Processo

Existem vários reagentes e protocolos para o teste da oxidase, todos com o mesmo propósito.

Reagentes

Reagente de Kovacs, reagente de Gordon e McLeod, reagente de Nadi, reagente de Carpenter, Suhrland e Morrison e uso de discos de oxidase.

-Reagente Kovacs oxidase

É composto por dicloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina a 1%.

O reagente de Kovacs é preparado dissolvendo 1 g da substância acima mencionada em 50 ml de água destilada. É aquecido sutilmente até que esteja completamente dissolvido. Transfira para uma garrafa âmbar de capacidade suficiente e complete o volume para 100 ml com água destilada. Espere pelo menos 15 minutos antes de usar. Conservar no refrigerador protegido da luz.

É rotulado como reagente Kovacs oxidase, para diferenciá-lo do reagente Kovacs usado para revelar o teste de indol. Este reagente é o mais sensível, menos tóxico, mas mais caro do que o resto dos reagentes.

Uma reação positiva será evidenciada com este reagente com a mudança da cor da colônia para lilás, que rapidamente se transforma em roxo quase preto. A reação negativa é evidente porque não há mudança de cor na colônia ou adquire uma leve coloração rosada. O meio também pode escurecer, mas isso não significa uma reação positiva.

Com este reagente, o tempo de reação é crucial, uma mudança de cor que ocorra entre 5 a 15 segundos é considerada uma reação positiva.

-Reagente Gordon e McLeod

É composto por dicloridrato de dimetil-p-fenilenodiamina, também conhecido como N-dimetil-p-fenilenodiamina ou monocloridrato de p-aminodimetilanilina. É preparado conforme descrito para o reagente Kovacs oxidase, em substituição à substância envolvida.

Este reagente é ligeiramente mais estável do que o reagente Kovacs oxidase, embora todos os reagentes contendo p-fenilenodiamina sejam instáveis.

Esta reação é mais tarde, é interpretada como positiva com o aparecimento de uma cor azul púrpura dentro de 10 a 30 minutos.

Reagente -Nadi

É composto por 1% de α-naftol em álcool etílico (95% etanol) e 1% de aminodimetilanilina. A mistura é preparada em partes iguais e usando álcool etílico absoluto como diluente, até perfazer a quantidade suficiente para 100 ml.

- Reagente Carpenter, Suhrland e Morrison

É composto por oxalato de p-aminodimetilalanina a 1%. Prepare da mesma forma que o descrito para o reagente Kovacs oxidase, mudando para a substância correspondente.

Com a solução pronta, as tiras de teste são preparadas como segue: Tiras de papel de filtro Whatman No. 1 de 6-8 cm são impregnadas com reagente oxalato de dimetil-p-fenilenodiamina a 1%.

Eles podem secar sem contato com metal, armazenar em potes com tampa de rosca com dessecante e armazenar na geladeira. Essas tiras são estáveis ​​por até 6 meses.

É o reagente mais estável de todos os mencionados, podendo durar até 6 meses em solução. Outro ponto positivo é que não tinge o meio ao redor da colônia, se usado diretamente na placa.

O aparecimento de uma cor vermelha é interpretado como um teste positivo.

- Discos de oxidase

São discos comerciais que são impregnados com reagente para teste de oxidase. Existem várias marcas registradas no mercado.

Seu uso é bastante prático, pois não é necessário o preparo de reagentes frescos, o que facilita o trabalho. Os resultados obtidos são confiáveis, desde que os discos sejam devidamente preservados.

Protocolos

Método de placa direta, método indireto sobre papel e uso de discos impregnados com reagentes de oxidase.

- Método de placa direta

2 ou 3 gotas de qualquer um dos reagentes acima mencionados são adicionadas para este fim diretamente na (s) colônia (s) contida (s) em uma placa de meio de cultura que não contém glicose.

A mudança ou não de cor das colônias é interpretada, não do meio. O tempo de reação válido depende do reagente usado.

- Método indireto no papel

Corte um pedaço de papel de filtro (Whatman No. 1) em um tamanho de 6 cm2 e é colocado dentro de uma placa de Petri vazia.

Adicionar 2 ou 3 gotas do reagente Kovacs oxidase ao papel, retirar parte da colônia a ser estudada com cabo de platina ou palito de madeira e espalhar em linha reta sobre o papel impregnado com reagente. Execute em 5 a 10 segundos.

Com as tiras preparadas com os reagentes Carpenter, Suhrland e Morrison, uma colônia é espalhada na tira seca. Uma única tira é usada para testar várias cepas. Interprete em 10 seg.

-Discos (mmétodo direto)

Umedeça sutilmente os discos comerciais com água destilada estéril e sobreponha na colônia a ser estudada. Recomenda-se a utilização das placas a 35 ° C, se forem utilizadas placas à temperatura ambiente ou refrigeradas a reação é um pouco mais lenta. Interprete a mudança de cor entre 10 a 20 seg.

Podem ser usadas colônias contidas em ágar sangue ou chocolate.

-Discos (método indireto)

Umedeça o disco conforme descrito anteriormente. Coloque-o em uma placa de Petri vazia. Pegue uma quantidade suficiente da colônia para estudar com um cabo de platina ou um palito de madeira e coloque no disco. Interprete a mudança de cor entre 10 a 20 seg.

Usar

Os gêneros Neisseria e Acinetobacter às vezes são muito semelhantes morfologicamente porque, embora o gênero Acinetobacter seja um bastonete Gram-negativo, às vezes pode assumir a forma cocóide e se distribuir aos pares, simulando o gênero Neisseria.

Nesse caso, o teste da oxidase é muito útil. O gênero Neisseria é positivo e Acinetobacter negativo.

No entanto, o gênero Moraxella é muito semelhante ao gênero Neisseria e ambos apresentam uma reação positiva; É por isso que testes de fermentação de carboidratos devem ser sempre realizados para identificação definitiva.

Por outro lado, o teste da oxidase é útil para diferenciar uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae (todas oxidase negativas) de outros fermentadores, como o gênero Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase positiva).

Os gêneros Vibrio e Helicobacter também são positivos para oxidase.

Controle de qualidade

Use cepas conhecidas de Escherichia coli como controle negativo e cepas de Pseudomonas aeruginosa como um controle positivo.

Limitações

-Os reagentes devem ser utilizados preparados na hora, sua vida útil em solução à temperatura ambiente é curta, pois são muito instáveis. Refrigerados, podem durar de 5 dias a 2 semanas.

-Os reagentes são incolores, se mudarem de cor devem ser descartados. Os discos danificados aparecem porque escurecem com o tempo.

-Uma reação positiva com o reagente Kovacs oxidase entre 15-60 segundos é considerada uma reação retardada e após 60 segundos deve ser considerada negativa.

-O Haemophylus influenzae dá uma reação de oxidase negativa se qualquer reagente com dimetil-p-fenilenodiamina for usado, mas positiva se o reagente de oxidase de Kovacs (tetrametil-p-fenilenodiamina) for usado.

-Mídia contendo glicose interfere no teste, dando falsos negativos.

-As cepas de Bordetella pertussis eles podem dar uma reação falso positiva se vierem de placas de ágar sangue altamente concentradas.

-O uso de cabos de metal (ferro) dá uma reação falso positiva.

recomendações

- Como os reagentes são muito instáveis ​​e tendem a se auto-oxidar, é recomendado congelar alíquotas de 1 a 2 ml e remover conforme necessário.

-Outra forma de retardar a auto-oxidação do reagente é adicionar 0,1% de ácido ascórbico ao preparar os reagentes.

-Como os reagentes são instáveis, recomenda-se um controle de qualidade semanal.

-Reagentes que não passam no teste de controle de qualidade não devem ser usados.

Referências

  1. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  3. "Teste de Oxidase".Wikipédia, a enciclopédia livre. 15 de janeiro de 2018, 10:32 UTC. 3 de abril de 2019, 14:03
  4. Organização Mundial de Saúde. Manual de Laboratório para a Identificação e Teste de Suscetibilidade Antimicrobiana de Patógenos Bacterianos de Importância para a Saúde Pública no Mundo em Desenvolvimento, 2004. Disponível em: who.int/drugresistance/infosharing
  5. Tiras reagentes para o diagnóstico da atividade da oxidase em bactérias. Rev Cubana Med Trop [Internet]. 2000; 52 (2): 150-151.