Tampão Fosfato (PBS): Justificativa, Preparação e Usos - Ciência - 2023

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o tampão fosfato, BPS ou solução salina tampão fosfatoé uma solução tampão e isotônica, cuja função é manter o pH e a pressão osmótica o mais próximo do ambiente biológico natural (fisiológico). A sigla PBS significa solução salina tamponada com fosfato.

O pH e a osmolaridade são dois aspectos muito importantes que devem ser controlados em determinados protocolos de laboratório. No caso do pH, é imprescindível que ele seja controlado, principalmente nas reações bioquímicas, pois estas podem variar ou não ser realizadas se os reagentes estiverem com pH inadequado.

Já o controle da osmolaridade é essencial principalmente quando se trabalha com células vivas, uma vez que as membranas plasmáticas das células reagem de acordo com a concentração de solutos em que se encontram.

Se as células forem transferidas para um meio hipertônico, elas ficarão desidratadas, pois o gradiente de água será transportado para o lado onde há maior concentração de solutos. Se, por outro lado, as células são colocadas em um meio hipotônico, as células irão absorver o líquido até serem lisadas.

É por isso que o buffer PBS é usado para protocolos de laboratório que requerem a manutenção de células. em vitro, desta forma as células não serão danificadas.

O PBS é composto por uma combinação de sais, como cloreto de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio e fosfato de potássio. A composição do PBS pode variar dependendo do protocolo.

Base

Basicamente, a função do tampão fosfato salino é manter um pH fisiológico constante junto com uma concentração de eletrólitos semelhante à encontrada dentro do corpo.

Nesse ambiente, as células conseguem se manter estáveis, já que as condições fisiológicas são simuladas o máximo possível.

Outros compostos podem ser adicionados à formulação de PBS original se necessário, por exemplo, a adição de EDTA ao tampão é útil para a lavagem de glóbulos vermelhos no teste de incompatibilidade cruzada.

O EDTA evita que a fração do complemento C1 presente no soro seja clivada e lisada em hemácias, ou seja, evita falsos resultados de incompatibilidade. Além disso, o EDTA ajuda a dissociar as células.

Preparação

A quantidade de sais que deve ser pesada para a preparação da solução salina tamponada com fosfato de PBS dependerá da quantidade que precisa ser preparada:

-Solução estoque salina tamponada com fosfato (10X PBS)

Para um litro de solução:

Pesar:

80,6 g de NaCl,

2,2 g de KCl,

11,5 g de Na₂HPO₄,

2,0 g KH₂HPO₄

Técnica de preparação

Coloque os sais pesados em um béquer, adicione água suficiente (80%) e misture na placa de agitação com barra magnética até que os sais se dissolvam.

Filtre para remover partículas não dissolvidas. Use filtros com poros de 0,45 µm. Autoclave e distribua assepticamente em uma capela de fluxo laminar em potes de vidro com tampa.

A solução 10X (concentrada) não ajusta o pH. O ajuste é feito uma vez diluído para a concentração de tampão PBS 1X, (diluição 1:10).

- Tampão de fosfato salino (1X PBS)

1X PBS pode ser preparado diretamente, pesando as quantidades correspondentes de cada sal, ou pode ser preparado diluindo a solução estoque (1:10) com água destilada estéril.

- Para preparar diretamente um litro de solução salina tamponada com fosfato 1X PBS, pesar:

8,06 g de NaCl,

0,22 g de KCl,

1,15 g Na₂HPO₄,

0,20 g KH₂HPO₄

Técnica de preparação

Proceda conforme explicado na solução concentrada. Posteriormente, o pH deve ser ajustado. Para isso, meça o pH e dependendo do resultado use ácido (HCl) ou base (NaOH) para diminuir ou aumentar o pH respectivamente, conforme necessário, até que seja 7,4.

O ácido ou a base são adicionados gota a gota enquanto se monitora o valor de pH da solução usando um medidor de pH. Filtre, autoclave e distribua assepticamente em tubos cônicos ou frascos, conforme necessário.

- Para preparar 1X PBS a partir da solução estoque 10X:

Faça uma diluição de 1:10. Por exemplo, para preparar 1 litro de 1X PBS, meça 100 ml da solução estoque e adicione 700 ml de água destilada estéril. Ajuste o pH e encha a quantidade de água até 1000 ml.

O tampão PBS preparado é incolor e transparente.

O PBS diário pode ser armazenado em temperatura ambiente e o restante na geladeira.

Soluções para ajuste de pH

HCl

Para 100 ml de HCL 1 molar (ácido clorídrico).

Meça 91 mL de água destilada e coloque em um copo de 250 mL.

Meça 8,62 mL de HCl concentrado e adicione lentamente no béquer que contém a água (nunca faça o contrário). Tome as medidas de biossegurança adequadas ao manusear ácidos fortes (substância altamente corrosiva).

Misture por 5 minutos, de preferência usando uma placa de agitação com uma barra magnética dentro do vidro. Transfira para um balão de 100 ml e complete a 100 ml com H₂Ou destilado.

NaOH

Para 100 ml de NaOH (hidróxido de sódio) 10 molar.

Meça 40 mL de água destilada e coloque em um copo de 250 mL. Meça 40 g de NaOH e adicione à água. Misture usando uma placa de agitação com uma barra magnética dentro do vidro.

Transferir para um balão volumétrico de 100 ml e perfazer a marca com água destilada. Cumprir as normas de biossegurança, pois essa reação é exotérmica (libera energia na forma de calor).

Se você quiser preparar outras quantidades de solução salina de fosfato, pode consultar a seguinte tabela:

Formulários

É usado principalmente em biologia celular, imunologia, imunohistoquímica, bacteriologia, virologia e laboratórios de pesquisa.

É ideal para lavagem de células por centrifugadoras (hemácias), lavagens de monocamadas de células, em técnicas de elipsometria espectroscópica, na quantificação de biofilmes bacterianos, na manutenção de culturas de células para vírus, como solução de lavagem na técnica de imunofluorescência indireta e em técnicas de caracterização de anticorpos monoclonais.

Também é utilizado no transporte de células ou tecidos, como diluente para contagem de células, preparação de enzimas celulares (tripsina), como diluente para o método de dessecação de biomoléculas e para preparar outros reagentes.

Por outro lado, Martin et al., Em 2006, demonstraram que o PBS é útil em laboratórios de ciência forense, especificamente na recuperação de espermatozoides de esfregaços vaginais ou na recuperação de células vaginais de esfregaços penianos. Desta forma, pode ser estabelecido se houve uma relação sexual.

Limitações

-Alguns tampões de PBS contêm uma substância chamada azida de sódio como conservante. Este composto pode gerar substâncias explosivas se entrar em contato com chumbo ou cobre. Por esse motivo, cuidado especial deve ser tomado ao descartar esse reagente no ralo. Se for descartado desta forma, deve-se adicionar bastante água para diluí-lo o máximo possível.

- O zinco não deve ser adicionado ao tampão de fosfato, pois causa a precipitação de alguns sais.

-Wangen et al., Em 2018 determinaram que o uso de PBS não era adequado para lavagem de células primárias de leucemia mieloide aguda (LMA) extraídas de sangue periférico, devido ao fato de muitas células serem perdidas por lise, com grande diminuição do material proteína.

Portanto, eles determinaram que as células AML primárias não devem ser lavadas com PBS após armazenamento em nitrogênio líquido.

Referências

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Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. O método de preservação e a lavagem com solução salina tamponada com fosfato afetam o proteoma da leucemia mieloide aguda.Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Disponível em: ncbi.nlm.nih.gov
Martínez R, Gragera R. (2008). Fundamentos teóricos e práticos da histoquímica. Conselho Superior de Investigações Científicas. Madrid. Disponível em: books.google.co.ve