Sequenciamento de DNA: Maxam-Gilbert, método e exemplos - Ciência - 2023

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o Sequenciamento de DNA (ácido desoxirribonucléico) é um procedimento realizado em laboratórios de biologia molecular que permite conhecer a ordem dos nucleotídeos no material genético de interesse. Além disso, a sequenciação de RNA (ácido ribonucleico) também pode ser divulgada.

Essa técnica tem sido indispensável para o desenvolvimento das ciências biológicas. Também é aplicável a outras áreas do conhecimento - como diagnóstico médico e investigação forense, por exemplo.

Anteriormente, o sequenciamento de uma fita de DNA era considerado uma atividade lenta e cara, o que permitia a identificação de apenas alguns pares de bases nos oligonucleotídeos.

Hoje, com todos os avanços da ciência, o sequenciamento de DNA é uma operação de rotina em muitos laboratórios em todo o mundo, graças à contribuição de quase 50 anos de pesquisa neste campo. Em termos de comprimento da cadeia, até milhões de pares de bases podem ser sequenciados em um tempo muito curto.

Para isso, foram desenvolvidas dezenas de técnicas que variam em preço e precisão. Neste artigo, descreveremos as técnicas clássicas e modernas, cada uma com suas vantagens e desvantagens.

Até o momento, as técnicas de sequenciamento permitem a obtenção da sequência de genomas completos, desde pequenos procariotos e leveduras até o genoma humano.

Estrutura do DNA

Para entender os métodos e técnicas usados para o sequenciamento de DNA, é necessário conhecer alguns aspectos essenciais da estrutura e composição da molécula.

O DNA é uma biomolécula encontrada em todos os seres vivos, desde bactérias até grandes animais aquáticos. Organelas - como mitocôndrias e cloroplastos - têm uma molécula de DNA circular dentro delas. Mesmo em alguns vírus, o material genético encontrado é o DNA.

Estruturalmente, o DNA é uma coleção de nucleotídeos. Cada um é composto por um carboidrato, uma base nitrogenada (A, T, C ou G) e um grupo fosfato. O objetivo do sequenciamento de DNA é revelar a ordem em que as quatro bases nitrogenadas são encontradas na sequência.

História

Em meados da década de 1950, os pesquisadores Watson e Crick descreveram a estrutura do DNA usando técnicas cristolográficas. No entanto, nenhum desses pesquisadores foi capaz de encontrar uma maneira de desvendar a sequência.

Embora houvesse alguns predecessores, o acontecimento mais importante foi a criação do método Sanger, em 1977. Frederick Sanger, o pai do método, foi um bioquímico britânico, ganhador de dois prêmios Nobel por suas enormes contribuições para as ciências biológicas.

Esta técnica também é conhecida na literatura como "terminação de cadeia" ou didesoxinucleotídeos. Os princípios desta técnica e aqueles que foram desenvolvidos a partir de seu aprimoramento e inovação serão descritos a seguir.

Método Sanger

O desenvolvimento do método Sanger representou um evento crucial na biologia molecular. Envolve os componentes básicos do processo de replicação do DNA que normalmente ocorre na célula, mas adicionando um componente especial: os didesoxinucleotídeos.

Principais componentes da reação

- DNA polimerase: a enzima DNA polimerase é um elemento crucial do processo. Essa molécula participa da replicação da fita de DNA e sua função é a síntese da nova fita, pareando os desoxirribonucleotídeos trifosfato com os complementares.

Lembre-se de que no DNA, as timinas (T) emparelham-se com as adeninas (A) por meio de duas ligações de hidrogênio, enquanto a citosina (C) o faz com a guanina (G) por meio de três ligações.

- Nucleotídeos: o sequenciamento Sanger envolve dois tipos de nucleotídeos, os quatro 2'-desoxinucleotídeos (abreviados como dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e os quatro didesoxinucleotídeos especiais (ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP).

Embora os didesoxinucleotídeos sejam semelhantes aos monômeros que normalmente são incorporados ao DNA, eles não possuem um grupo -OH em sua estrutura. Isso torna impossível adicionar um novo nucleotídeo à cadeia.

Portanto, quando um nucleotídeo especial é adicionado - de forma totalmente aleatória - à cadeia em formação, a síntese é paralisada. Assim, ao final da reação, existem cadeias de tamanhos diferentes, cada uma onde a reação foi interrompida em um ponto diferente.

Experimentalmente, quatro testes são preparados. Cada um contém o DNA extraído da amostra biológica de interesse, os nucleotídeos normais e um dos quatro tipos especiais de nucleotídeos. Ou os nucleotídeos especiais são marcados com algum tipo de marcador fluorescente (veja o sequenciamento automático abaixo).

Lendo os resultados

O primeiro passo é separar cada uma das cadeias sintetizadas de acordo com seu tamanho. Alguns serão mais longos do que outros, dependendo de onde as bases especiais foram incorporadas.

Existem diferentes técnicas bioquímicas que permitem a separação dos componentes de uma mistura utilizando o tamanho como propriedade discriminatória. No método de Sanger, as diferentes cadeias são separadas por eletroforese. Nas variantes mais sofisticadas da técnica, a eletroforese capilar é usada.

Assim, os fios mais longos viajam menos do que as variantes mais curtas. Este sistema então passa por um leitor que reconhece o marcador incluído em cada didesoxinucleotídeo. Desta forma, a ordem da sequência pode ser conhecida.

Esta técnica de "primeira geração" é capaz de ler fragmentos de DNA não maiores que 1 quilobase. Atualmente, o método Sanger é usado em vários laboratórios, geralmente em suas variantes modernas. Além disso, é utilizado para corroborar os resultados obtidos com as técnicas mais complexas - porém menos precisas.

Sequenciamento automático

Quando o sequenciamento é necessário em grande escala, o processo é acelerado por meio da automação. Esta é uma variação do método de terminação de cadeia de Sanger, onde os primers são marcados com produtos fluorescentes para distingui-los.

Posteriormente, o produto da reação é executado em uma eletroforese - tudo em uma única pista. À medida que cada fragmento sai da porção final do gel, é rapidamente identificado por sua marcação fluorescente, com erro em torno de 1%.

Os sistemas mais sofisticados possuem um sistema de até 96 tubos capilares gerenciados por um computador acoplado a um robô. Ou seja, 96 amostras de DNA podem ser testadas simultaneamente. Assim, o processo envolvendo eletroforese e análise dos resultados é totalmente automatizado.

Em um dia, esses sistemas podem sequenciar até 550.000 bases. Durante o processo, o trabalho humano é desnecessário, leva apenas cerca de 15 minutos para iniciar o método.

Sequenciamento Maxam-Gilbert

Ao mesmo tempo em que Sanger publicou seu trabalho, dois pesquisadores chamados Allan Maxan e Walter Gilbert conseguiram desenvolver outro método para obter a sequência de DNA. O método ganhou popularidade na época, mas foi posteriormente substituído pelo aprimoramento do método de Sanger.

Ao contrário do método Sanger, o sequenciamento de Maxan e Gilbert (ou sequenciamento químico, como também é conhecido) não envolve reações de hibridização. A metodologia consiste na marcação com agentes reativos em uma extremidade, seguida de um processo de purificação.

Um dos aspectos negativos desta técnica reside na sua enorme complexidade e na utilização de produtos químicos perigosos para o utilizador. As quebras químicas são induzidas pela aplicação de DMS, ácido fórmico, hidrazina e hidrazina com sais.

Processo

O protocolo começa com a marcação na extremidade 5 'da fita com o marcador de fósforo 32, então ocorre uma modificação química da base de nitrogênio e ela é separada. Finalmente, ocorre a clivagem da região abásica.

Primeiro você encurta a cadeia que deseja sequenciar em segmentos menores. Esta etapa é realizada com enzimas de restrição, que resultam em extremidades salientes.

Em seguida, a reação é realizada com uma fosfatase alcalina, cujo objetivo é eliminar o grupo fosfato. Assim, uma quinase polinucleotídica pode ser usada para realizar a marcação.

A corrente é desnaturada (os dois fios se abrem). Em seguida, os produtos químicos são aplicados. Essas reações de clivagem são feitas de forma controlada e sabe-se quais são os tipos de ligações que cada químico aplicado quebra.

Lendo os resultados

Assim como no método Sanger, a leitura dos resultados envolve a separação por tamanho das cadeias obtidas em um sistema de eletroforese. Os sistemas compostos por poliacrilamida permitem obter uma resolução bastante adequada para a leitura do gel.

Sequenciamento em massa

O sequenciamento massivo engloba uma série de novos métodos, abreviados como NGS, do inglês "Sequenciamento de próxima geração ”.

Os métodos classificados como NGS requerem uma etapa prévia de amplificação do DNA (eles não funcionam com uma única molécula). Além disso, as plataformas usadas variam amplamente. Os princípios dos métodos mais populares serão descritos abaixo:

Pirosequenciamento

Envolve monitorar a liberação de um pirofosfato, que ocorre cada vez que um novo nucleotídeo é adicionado à fita de DNA. Um sistema de enzimas é acoplado, de forma que a emissão de luz (que é detectável por uma câmera) ocorra cada vez que um novo nucleotídeo é incorporado.

O processo começa com a incubação separada de cada base de nitrogênio para verificar se há ou não emissão de luz. O pirosequenciamento pode ler fios longos, mas a taxa de erro encontrada é alta.

Sequenciamento de síntese

Isso envolve a incorporação de nucleotídeos marcados. Esses componentes fluorescentes são adicionados, lavados e o nucleotídeo incorporado é anotado. Em seguida, o marcador de nucleotídeo é removido e a síntese da fita pode continuar. Na próxima etapa, um nucleotídeo marcado também será incorporado, e as etapas acima serão repetidas.

Uma desvantagem dessa técnica ocorre quando os marcadores fluorescentes não são removidos completamente. Essas emissões criam erros de segundo plano, resultando em erros significativos.

Sequenciamento de ligadura

Essa técnica difere das demais por não utilizar DNA polimerase. Em vez disso, a enzima chave para esta metodologia é a ligase. Aqui, fragmentos de DNA marcados com fluorescência são usados, ele é ligado pela enzima e é detectado.

O maior problema com essa técnica é o comprimento do fragmento curto que ela é capaz de processar.

Sequenciamento Ion Torrent

Esta técnica é baseada na medição do íon H⁺que é liberado cada vez que um novo nucleotídeo é incorporado. O princípio é bastante semelhante ao do pirosequenciamento, mas muito mais barato.

Exemplos

O sequenciamento do genoma humano

Sequenciar o genoma humano tem sido um dos desafios mais promissores da biologia, além de ser uma das rivalidades mais aclamadas da história da ciência. Na verdade, para os cientistas envolvidos no projeto, o sequenciamento do genoma tornou-se uma competição.

Em 1990 deu início ao que se chamou de "projeto genoma humano", liderado pelo famoso cientista James Watson, ganhador do Prêmio Nobel. Depois de um ano, em 1991, Venter assume o desafio de "derrotar" Watson e sequenciar o genoma antes dele. Porém, em 1992, Watson se aposentou e o comando foi assumido por outro pesquisador.

Em 1995, Venter anunciou seu sucesso no sequenciamento completo de um genoma bacteriano pelo método de sequenciamento aleatório. Da mesma forma, a equipe adversária anunciou um ano depois o sequenciamento do genoma da levedura.

No ano de 2000, a corrida foi encerrada. Ambas as empresas publicaram seus resultados preliminares do genoma completo em duas das revistas científicas de maior prestígio: Natureza Y Ciência.

No entanto, os cientistas continuaram a trabalhar para melhorar as propostas e, em 2006, as sequências de alguns cromossomos humanos foram concluídas.

Importância e aplicações

Saber a ordem dos nucleotídeos de uma molécula tão importante como o DNA é valioso para biólogos e profissionais relacionados. Essa cadeia de polinucleotídeos contém todas as informações necessárias para o desenvolvimento e manutenção de todas as formas de vida.

Por essas razões, o conhecimento dessa sequência é essencial para a pesquisa biológica. Fundamentalmente, o sequenciamento permite que uma das propriedades mais importantes dos sistemas biológicos seja medida e estabeleça diferenças entre eles.

O sequenciamento é amplamente utilizado por taxonomistas e sistematas, uma vez que certas sequências de DNA permitem estabelecer critérios para concluir se dois organismos pertencem ou não à mesma espécie, além de poder propor hipóteses sobre as relações filogenéticas entre eles.

Além disso, o sequenciamento de DNA tem aplicações em medicina e diagnóstico. Por exemplo, existem sistemas baratos e acessíveis que, por meio do sequenciamento, permitem avaliar a tendência ao desenvolvimento de certas doenças (como o câncer) por meio dos chamados polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).

As investigações do tipo criminal e forense também foram enriquecidas com técnicas de sequenciamento, que podem ser utilizadas como evidência confiável da participação de determinado indivíduo em um crime.

Referências

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