DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol): características, justificativa, uso - Ciência - 2023

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o DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) É um corante que, por sua propriedade fluorescente, serve como marcador, sendo amplamente utilizado na técnica de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo, entre outras. A fluorescência que ele emite é azul brilhante, sua excitação ocorre entre 455-461 nm (luz UV).

A coloração DAPI pode passar através da membrana celular de células mortas com grande facilidade. Também pode manchar o núcleo das células vivas, mas, neste caso, a concentração deste deve ser maior.

O corante é capaz de acessar o DNA celular pelo qual possui afinidade especial, ligando-se com grande avidez às bases nitrogenadas adenina e timina. Por este motivo, é muito útil em algumas técnicas de biologia molecular.

Este composto pertence ao grupo dos corantes indol e demonstrou ter maior sensibilidade ao DNA do que o brometo de etídio e o iodeto de propídio, especialmente em géis de agarose.

O uso desse corante fluorescente é muito amplo, pois é útil para: estudar mudanças no DNA em processos apoptóticos (morte celular) e, portanto, detectar células neste processo; para foto de pegada de DNA (impressão de foto de DNA); estudar contaminação bacteriana; ou para visualizar a segmentação nuclear.

Também tem sido utilizado no estudo de bandas cromossômicas, na detecção de DNA deMycoplasmas sp, na interação DNA-proteína, na coloração e contagem de células por imunofluorescência e até na coloração de grãos de pólen maduros.

Caracteristicas

DAPI é a abreviatura de seu nome químico (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Sua fórmula molecular é C₁₆H₁₅N_5. Ele tem um peso molecular de 350,3. Perto da faixa de luz UV (345 a 358 nm) ocorre a excitação máxima do complexo DAPI-DNA, enquanto a emissão máxima de fluorescência ocorre entre 455-461 nm.

Este corante é caracterizado por ser um pó amarelo, mas as estruturas marcadas com este fluoróforo emitem uma luz azul brilhante.

É um composto solúvel em água, porém, para acelerar sua dissolução, algum calor pode ser aplicado. Ele pode ser diluído com PBS, mas não diretamente dissolvido nele.

Uma vez preparado o corante, deve ser armazenado no escuro, ou seja, protegido da luz, a uma temperatura de 2 a 8 ° C (refrigerador). Nessas condições, o corante é estável por mais de 3 semanas ou meses.

Se for protegido da luz, mas deixado em temperatura ambiente, sua estabilidade cai para 2 ou 3 semanas, mas exposto à luz direta a deterioração é muito rápida. Se desejar armazenar por muito mais tempo, pode ser refrigerado a -20 ° C distribuído em alíquotas.

Base

Essa coloração é baseada na geração de uma contracoloração nuclear nas principais técnicas de biologia molecular, tais como: citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e coloração de cromossomos metafásicos ou núcleos interfásicos, entre outras.

Essa técnica se baseia na grande afinidade que o corante tem pelas bases nitrogenadas (adenina e timina) contidas no material genético (DNA) do sulco menor. Enquanto no nível citoplasmático, deixa muito pouco fundo.

Quando o corante fluorescente se liga às regiões de adenina e timina do DNA, a fluorescência aumenta significativamente (20 vezes mais). A cor que emite é azul brilhante. Notavelmente, não há emissão de fluorescência quando se liga aos pares de bases GC (guanina-citosina).

É importante observar que embora também tenha afinidade pelo RNA, isso não causa problemas, pois o maior grau de emissão de energia dessa molécula ocorre em outro comprimento de onda (500 nm), ao contrário do DNA, que o faz a 460 nm. Além disso, o aumento da fluorescência, uma vez ligado ao RNA, é de apenas 20%.

DAPI é mais usado para corar células mortas (fixas) do que células vivas, uma vez que uma concentração muito maior do corante é necessária para corar as últimas, isso porque a membrana celular é muito menos permeável a DAPI quando está viva.

O corante DAPI pode ser usado em combinação com fluoróforos vermelhos e verdes para uma experiência multicolorida.

Usar

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) é um excelente fluoróforo e, portanto, é amplamente utilizado em várias técnicas e para vários fins. O uso do DAPI nas principais técnicas é explicado a seguir.

Citometria de fluxo

Os pesquisadores Gohde, Schumann e Zante em 1978 foram os primeiros a usar e propor o DAPI como fluoróforo na técnica de citometria de fluxo, tendo grande sucesso devido a sua alta sensibilidade ao DNA e sua alta intensidade na emissão de fluorescência.

O uso de DAPI nesta técnica permite o estudo do ciclo celular, a quantificação de células e a coloração de células vivas e mortas.

Embora existam outros corantes, como brometo de etídio, óxido de Hoechst, laranja de acridina e iodeto de propídio, o DAPI é um dos mais utilizados por ser mais fotoestável do que os citados anteriormente.

Para essa técnica é necessário fixar as células, para isso pode-se usar etanol absoluto ou paraformaldeído 4%. A amostra é centrifugada e o sobrenadante descartado, posteriormente as células são hidratadas pela adição de 5 ml de tampão PBS por 15 minutos.

Enquanto o tempo passa, prepare o corante DAPI com um tampão de coloração (FOXP3 da BioLegend) a uma concentração de 3 µM.

Centrifugue a amostra, descarte o sobrenadante e cubra com 1 ml de solução DAPI por 15 minutos em temperatura ambiente.

Leve a amostra ao citômetro de fluxo com o laser apropriado.

Microfluorometria de fluxo

Outra técnica em que o DAPI é usado é em microfluorometria de fluxo junto com outro fluoróforo chamado mitramicina. Ambos são úteis para quantificar DNA de cloroplasto individualmente, mas o DAPI é mais adequado para medir partículas de bacteriófago T4.

Hibridizaçãono local

Esta técnica usa basicamente sondas de DNA marcadas com um corante fluorescente que pode ser DAPI.

A amostra requer tratamento térmico para desnaturar o DNA de fita dupla e convertê-lo em duas fitas simples. É subsequentemente hibridizado com uma sonda de DNA desnaturado marcada com DAPI que possui uma sequência de interesse.

Depois é lavado para eliminar o que não foi hibridizado, um contraste é usado para visualizar o DNA. O microscópio de fluorescência permite a observação da sonda hibridizada.

Essa técnica tem por objetivo detectar sequências específicas no DNA cromossômico, podendo fazer o diagnóstico de certas doenças.

Essas técnicas cito-moleculares têm sido de grande ajuda na determinação de detalhes no estudo dos cariótipos. Por exemplo, ele evidenciou as regiões ricas em pares de bases de adenosina e timina chamadas regiões heterocromáticas ou bandas DAPI.

Essa técnica é amplamente utilizada para o estudo de cromossomos e cromatina em plantas e animais, bem como no diagnóstico de patologias pré-natais e hematológicas em humanos.

Nesta técnica, a concentração recomendada de DAPI é 150 ng / ml por um período de 15 minutos.

As lâminas montadas devem ser armazenadas protegidas da luz a 2-8 ° C.

Coloração de imunofluorescência

As células são fixadas com paraformaldeído a 4%. Se outras manchas forem usadas, o DAPI é deixado no final como uma contracoloração e as células são cobertas com solução de PBS por 15 minutos. Enquanto o tempo passa, prepare a solução DAPI diluindo com PBS, de modo que a concentração final seja 300 µM.

Em seguida, o excesso de PBS é removido e coberto com DAPI por 5 minutos. Lava várias vezes. A lâmina é vista em um microscópio de fluorescência sob o filtro apropriado.

Ficha de segurança

Este composto deve ser manuseado com cuidado, pois é um composto que possui propriedades mutagênicas. O carvão ativado é usado para eliminar este composto de soluções aquosas que devem ser descartadas.

Luvas, avental e óculos de segurança devem ser usados para evitar acidentes com este reagente. Se ocorrer contato com a pele ou mucosa, a área deve ser lavada com bastante água.

Você nunca deve pipetar este reagente com a boca, use pipetas.

Não contamine o reagente com agentes microbianos, pois isso pode levar a resultados errôneos.

Não dilua a coloração DAPI mais do que o recomendado, pois isso diminuirá significativamente a qualidade da coloração.

Não exponha o reagente à luz direta ou armazene no calor, pois isso diminui a fluorescência.

Referências

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