Meio Löwenstein-Jensen: fundação, preparação e uso - Ciência - 2023

Contente

o Meio Löwenstein-Jensen é um meio sólido seletivo para o isolamento e desenvolvimento de bactérias do gênero Mycobacterium, como Mycobacterium tuberculosis, M. avium, entre outras, com exceção da espécie leprae, que não é cultivável.

Bactérias do gênero Mycobacterium não crescem em meios de cultura convencionais, portanto foi necessário projetar um meio especial para o seu isolamento. O meio original foi criado por Löwenstein e posteriormente modificado por Jensen.

A modificação consistiu na eliminação do corante vermelho do Congo, substituindo-o por uma concentração maior de verde malaquita. Também alterou as concentrações de citrato de magnésio e fosfato monopotássico.

O meio Löwenstein-Jensen atualmente contém amido de batata, asparagina, citrato de magnésio, fosfato monopotássico, sulfato de magnésio, verde malaquita, ácido nalidíxico, cicloheximida, lincomicina, ovos batidos, glicerina e água.

As micobactérias normalmente são isoladas de locais não estéreis, como escarro, urina, abscessos, entre outros. Isso significa que a maioria das amostras conterá a microbiota usual da área, além do patógeno.

É por isso que o meio Löwenstein-Jensen contém uma série de inibidores em sua composição representados por verde malaquita, antibióticos e antifúngicos.

Além disso, as amostras provenientes de locais não estéreis devem ser descontaminadas e neutralizadas antes de serem semeadas no meio Löwenstein-Jensen.

Base

A presença de ovo e glicerina no meio de Löwenstein-Jensen estimula o crescimento de micobactérias, pois fornecem os ácidos graxos e proteínas necessários ao desenvolvimento desses microrganismos.

O meio Löwenstein-Jensen contém verde malaquita, que é um inibidor da microbiota que o acompanha. Mas também contém ácido nalidíxico (35 µg / mL), que inibe a microbiota Gram negativa, cicloheximida (400 µg / mL), que inibe fungos saprofíticos e leveduras, e lincomicina (2 µ / mL), que inibe a microbiota Gram positiva.

Algumas empresas comerciais preferem adicionar a seguinte combinação de antibióticos: polimixina B 200.000 unidades / L, anfotericina B 10 mg / L, carbenicilina 50 mg / L e trimetoprima 10 mg / L.

Este meio não contém ágar, portanto a solidificação do meio ocorre devido à coagulação da albumina presente no ovo durante a esterilização.

Preparação

Pesar 37,3 g do meio desidratado em 600 ml de água destilada à qual foram previamente adicionados 12 ml de glicerol. A mistura é aquecida, mexendo freqüentemente até a completa dissolução. Autoclave o meio a 121 ° C por 15 minutos.

Por outro lado, uma suspensão homogênea de 1000 ml de ovos frescos deve ser preparada em condições assépticas. Adicione a suspensão de ovo aos 600 ml de meio preparado à temperatura de 50 - 60 ° C, evitando bolhas de ar.

Soluções de antibióticos também são adicionadas após esterilização na autoclave.

Despeje o meio em tubos de ensaio estéreis com tampa de rosca. Aqueça os tubos a 85 ° C por 45 minutos em uma posição inclinada.

A cor do meio preparado é verde água-marinha e pode apresentar manchas esbranquiçadas devido à presença de lipídios do ovo.

O pH do meio deve ser 7,2 ± 0,2

Armazene os tubos na geladeira e protegidos da luz direta até o uso. Tempere antes de semear.

Há uma modificação do meio chamada "modificação Gruft do Löwenstein Jensen". Este contém os mesmos compostos que o meio clássico, mas RNA-5mg / 100 mL é adicionado, e como inibidores contém verde malaquita 0,025 g / 100 mL, penicilina 50 U / mL e ácido nalidíxico 35 ug / mL.

Formulários

O meio Löwenstein-Jensen é usado para o isolamento de micobactérias de vários tipos de amostras. A coloração Ziehl-Neelsen é recomendada para qualquer amostra na qual se suspeite da presença de micobactérias.

Algumas amostras vêm de locais estéreis, mas outras não. As amostras não estéreis devem ser descontaminadas conforme apropriado:

Escarro

As amostras de escarro devem ser descontaminadas da seguinte forma: determinar a quantidade de amostra de escarro em ml e adicionar a mesma quantidade de NaOH 4% à amostra e incubar a 37 ° C.

Agite a mistura freqüentemente dentro de 30 minutos. Posteriormente, centrifugue a 3000 RPM por 30 minutos.

Descarte o sobrenadante sobre uma solução desinfetante fenólica. Use o sedimento para a semeadura, mas primeiro o pH deve ser neutralizado.

Para neutralizar o sedimento, H₂SW₄ a 5% na presença do indicador vermelho de fenol até atingir um pH neutro que provoca uma cor salmão.

Lavagem gástrica, lavagem brônquica e aspirado brônquico

Neste caso, a amostra deve ser centrifugada a 3000 RPM por 30 minutos. O sobrenadante é descartado e o pellet é usado. Para descontaminar o sedimento, adicionar 3 ml de NaOH 4% e agitar freqüentemente a 37 ° C por um período de meia hora.

Centrifugue novamente, o sobrenadante é descartado e o pellet é usado. Este último deve ser neutralizado conforme explicado na amostra de escarro.

Urina

Deixe a amostra repousar na geladeira por 24 horas. Separe o sobrenadante. O pellet restante deve ser centrifugado por 30 minutos a 3000 RMP. Rejeite o sobrenadante novamente e reconstitua o pellet com 3 ml de solução fisiológica estéril.

Adicione 3 ml de NaOH a 4% e proceda à descontaminação e neutralização conforme descrito anteriormente.

Líquido ascite, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano

Nesse tipo de amostra, ela é centrifugada e o sobrenadante é descartado. Faça um Gram no sedimento ou observe diretamente no microscópio; Se bactérias não forem observadas, a etapa de descontaminação não é necessária, nem a etapa de neutralização.

Neste caso, a amostra pode ser semeada diretamente usando o sedimento. Se houver bactérias, proceda à descontaminação e neutralização conforme descrito acima.

Biópsias

A este tipo de amostra, deve-se adicionar 5 ml de água destilada para posteriormente centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e centrifugue novamente o pellet a 3500 RPM por 30 minutos. Use o sedimento para semear o meio de cultura.

Swab laríngeo

O swab deve ser inserido em um tubo estéril contendo partes iguais de água destilada e NaOH 4%. O cotonete deve ser pressionado contra as paredes do tubo para que a amostra seja diluída no líquido. Centrifugue e use o sedimento. Neutralize o sedimento conforme já descrito.

Semeado

O meio Löwenstein-Jensen é inoculado pela adição de 0,5 ml da amostra na superfície do meio. Gire o tubo para distribuir a amostra por todo o meio. Não use cabo de platina.

Um segundo tubo pode ser semeado contendo meio Stonebrink com a finalidade de isolar Mycobacterium bovis e outras espécies que não crescem no meio Löwenstein-Jensen.

Incubação

Os tubos inoculados são incubados aerobicamente a 37 ° C, com a tampa ligeiramente solta e inclinada a cerca de 5 ° e protegida da luz. O meio ambiente pode ser enriquecido com 5–10% de dióxido de carbono. Verifique as culturas duas vezes por semana até que as colônias apareçam.

Quando a amostra for absorvida, as tampas são fechadas. O tempo máximo de incubação é de 8 semanas, se após este tempo não houver crescimento é relatado como negativo.

Controle de qualidade

As seguintes cepas podem ser usadas como controle de qualidade:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Um excelente desenvolvimento é esperado para as três primeiras espécies mencionadas, para M. fortuitum o crescimento deve ser bom, enquanto para M. bovis pouco ou nenhum crescimento é esperado. Enquanto isso, espécies diferentes do gênero Mycobacterium devem ser totalmente inibidas.

Limitações

O meio preparado deve ser protegido da luz, a exposição prolongada à luz faz com que o meio passe de verde para azul, neste caso, o meio não pode mais ser usado. Isso ocorre porque o verde malaquita é fotossensível.

O meio, por conter ovos, pode ser facilmente contaminado se não for manuseado assepticamente. Ele pode ser dissolvido se ficar contaminado com bactérias proteolíticas.

O cultivo e o manejo de bactérias do gênero Mycobacterium requerem pessoal qualificado e atento às medidas de biossegurança que devem ser seguidas para evitar a contaminação ou contaminação de terceiros.

O HCl não deve ser usado na etapa de neutralização devido à formação de cloreto de sódio, que pode ser tóxico para o bacilo de Koch.

As amostras devem ser mantidas refrigeradas e protegidas da luz enquanto não estão sendo processadas.

Referência

Laboratórios Francisco Soria Melguizo. 2009. Meio seletivo Löwenstein-Jensen. Disponível em: f-soria.es
Britannia Laboratories. 2017. Meio Löwenstein-Jensen. Disponível em: britanialab.com.
Neogen Laboratories. Meio Löwenstein-Jensen. Disponível em: foodsafety.neogen.com.
"Meio Löwenstein-Jensen."Wikipédia, a enciclopédia livre. 20 de novembro de 2018, 15:15 UTC. 24 de abril de 2019, 18:34. wikipedia.org
Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.