Eletroforese: justificativa, técnica, para que serve, exemplos - Ciência - 2023

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o eletroforese É uma técnica usada para separar moléculas em um campo elétrico. Trata-se, especificamente, da migração de partículas carregadas sob a influência de uma corrente elétrica aplicada entre dois pólos, um positivo e outro negativo.

Atualmente, a eletroforese é talvez um dos procedimentos mais rotineiros que ocorrem durante o desenvolvimento de um experimento, principalmente nas áreas relacionadas à química analítica, bioquímica e ciências biológicas e médicas em geral.

É usado para separar proteínas, peptídeos, DNA, RNA e outras moléculas de acordo com sua carga, tamanho, densidade e pureza.

As diferentes casas comerciais conceberam diferentes formatos, com diferentes aplicações e utilidades adequadas para fins específicos, no entanto, todos os procedimentos requerem os mesmos elementos básicos:

- Uma fonte de energia para gerar a carga elétrica

- Um meio de suporte para que ocorra a separação

- Uma solução tampão (amortecedor) para manter o pH constante

Base

A eletroforese nada mais é do que a migração (separação) de partículas ou moléculas carregadas (natural ou artificialmente) em um meio ou suporte sob a influência de um campo elétrico.

A técnica é baseada em uma das principais equações físicas do eletromagnetismo, segundo a qual a força é igual à carga elétrica multiplicada pelo campo elétrico aplicado naquele ponto (F (força) = q (carga elétrica) x E (campo elétrico )).

De acordo com essa equação, duas partículas com a mesma massa, mas com cargas diferentes, se moverão em taxas diferentes no mesmo campo elétrico. Além disso, a velocidade do movimento dessas partículas dependerá da relação entre sua carga e sua massa.

Os cientistas têm aproveitado essas propriedades e relações carga / massa para separar os componentes das biomoléculas em suas menores partes, bem como para separar diferentes moléculas em uma mistura, entre outras aplicações.

É importante lembrar que moléculas biológicas, como aminoácidos, peptídeos, proteínas, alguns carboidratos, nucleotídeos e ácidos nucleicos, todos têm algo que chamamos de "grupos ionizáveis", de modo que podem existir como espécies carregadas positiva ou negativamente sob certas condições. pH.

Técnica

Embora existam vários tipos de eletroforese, a eletroforese em gel é a mais utilizada em análises bioquímicas, de biologia molecular e de biotecnologia, por isso será dela que falaremos brevemente em termos técnicos.

Como o próprio nome indica, a eletroforese em gel envolve o uso de um meio suporte sólido na forma de gel, seja para a análise / separação de misturas de proteínas ou ácidos nucleicos (DNA e / ou RNA) sob a influência de um campo elétrico.

O sistema ou aparelho usado para realizar uma "corrida" eletroforética em gel pode ser horizontal (geralmente usado para ácidos nucleicos) ou vertical (geralmente usado para proteínas).

- Exemplo de técnica de eletroforese de ácido nucleico

Os ácidos nucléicos são normalmente separados usando géis de agarose (polissacarídeo de galactose) que são preparados com uma solução tampão adequada (Tris / Acetato / EDTA ou Tris / Borato / EDTA) e cuja concentração irá determinar a "resolução" de fragmentos de diferentes tamanhos.

Preparação de amostra

A primeira etapa antes de realizar uma corrida eletroforética em um gel de agarose é obter a amostra. Isso dependerá do propósito experimental e as amostras podem ser o produto de uma digestão enzimática, uma reação em cadeia da polimerase (PCR), uma purificação de ácido nucleico, etc.

Após sua obtenção, é misturado a uma solução colorida (solução de carga) que permite a rápida deposição da amostra em um poço, pois possui glicerol e um corante que permite que a corrida seja acompanhada visualmente.

Preparação de gel

Esta etapa consiste em misturar a quantidade necessária do substrato gelificante (agarose) com a solução tampão, derretê-la com o calor e solidificá-la sobre um suporte que funciona como um “molde”.

Durante a gelificação, alguns “pentes” são introduzidos no gel posicionado no “molde” para delimitar os “poços” onde as amostras serão introduzidas antes da corrida.

Uma vez que o gel resfriou e solidificou, os "pentes" são removidos e introduzidos em um recipiente conhecido como "balde", que é preenchido com a solução tampão corrente, (Tris / Acetato / EDTA ou Tris / Borato / EDTA).

Essa cubeta, por sua vez, está incluída no que se denomina “câmara eletroforética”, que nada mais é do que o recipiente por onde passa o campo elétrico e que possui um espaço onde o gel é introduzido e duas seções que são preenchidos com solução tampão (amortecedor corre).

Esta câmara possui dois eletrodos, um positivo e outro negativo, entre os quais ocorre a movimentação dos íons após a aplicação de um campo elétrico (está conectada a uma fonte de energia).

Carregando amostras

Uma vez que as amostras tenham sido misturadas com a respectiva solução de carga, elas são introduzidas nos “poços” previamente feitos no gel.

Uma vez que os ácidos nucléicos têm uma carga líquida negativa, eles migram do pólo negativo para o positivo, então isso deve ser levado em consideração ao conectar a câmera à fonte de alimentação, certificando-se de que o pólo negativo corresponde ao máximo próximo ao local onde as amostras foram carregadas.

O tempo de execução é estabelecido na dependência estrita do pesquisador responsável pelo experimento. A voltagem é geralmente calculada em uma razão de 5 volts para cada centímetro de distância no gel que separa os dois eletrodos.

Exibição

Quando a corrida termina, o gel (quando as amostras percorrem o gel de uma extremidade a outra) é imerso em uma solução de brometo de etídio (EtBr), um corante que é imprensado entre as bases nitrogenadas e que as "marca". , para que possam ser visualizados em um transiluminador usando luz ultravioleta.

Para que serve a eletroforese?

A eletroforese tem sido usada historicamente para vários fins. Hoje, porém, sua utilidade depende em grande parte da "pergunta" que o pesquisador faz em relação a um determinado fenômeno ou sistema, bem como do tipo de eletroforese que deseja usar.

Podemos, no entanto, listar algumas das principais funções que esta técnica possui, começando pelas mais “raras” e terminando pelas mais populares e exploradas no mundo das ciências biológicas. A eletroforese é útil:

- Para a análise quantitativa de misturas complexas de macromoléculas e para o cálculo de potenciais "zeta" (propriedade coloidal de uma partícula em meio líquido sob a influência de um campo elétrico estático).

- Para a análise de soros sanguíneos para fins de diagnóstico.

- Para a separação de glicoproteínas, lipoproteínas e hemoglobina do sangue.

- Para a análise de alimentos, produtos farmacêuticos e poluentes ambientais.

Eletroforese em géis de agarose

- Para a separação de fragmentos de DNA após sua digestão com enzimas de restrição.

- Para a separação de moléculas de ácido nucleico antes de sua transferência para as membranas para análise posterior.

- Para a análise de produtos de PCR (reação em cadeia da polimerase) verificando se ocorreu ou não amplificação.

- Para estimar o tamanho das moléculas em uma mistura de DNA ou RNA.

- Estimar a quantidade e / ou qualidade dos ácidos nucléicos purificados.

Eletroforese em géis de poliacrilamida sob condições desnaturantes ou nativas

- Para determinar o tamanho de uma proteína.

- Para identificar proteínas.

- Para determinar a pureza de uma amostra após várias etapas de purificação.

- Identificar a presença de ligações dissulfeto intramoleculares.

- Para determinar a interação entre proteínas.

- Para determinar o ponto isoelétrico de uma proteína.

Fatores que afetam a eletroforese

A migração de uma partícula em um campo elétrico depende de vários fatores, entre os quais:

- Sua carga elétrica

- Seu tamanho molecular

- Sua hidrofobicidade e sua forma

- A magnitude do campo elétrico aplicado a ele

- A temperatura do sistema e a força iônica da solução tampão usada

- A natureza do ambiente onde está localizado

Em relação à amostra

Dentre os parâmetros relacionados às partículas (amostra) que são submetidas a um campo elétrico, os principais fatores que afetam esse processo têm a ver com sua carga, seu tamanho e sua forma.

Quanto maior a carga líquida em uma partícula, maior sua taxa de migração e essa magnitude dependerá do pH. No entanto, a relação com o tamanho é inversamente proporcional, o que significa que quanto "maior" a molécula, mais devagar ela migrará.

Em relação ao campo elétrico

Até agora falamos sobre a importância do campo elétrico para conseguir o movimento de uma partícula por eletroforese, mas não definimos o que é: força elétrica por unidade de carga ou, em termos mais simples, uma região do espaço onde existe uma força elétrica.

Os parâmetros relativos ao campo elétrico que podem afetar a migração são tensão, corrente e resistência.

A voltagem afeta o "tempo de vôo" das moléculas que se separam após a aplicação do campo elétrico. Quanto mais alto, mais rápido eles se movem.

A corrente (fluxo contínuo e uniforme de elétrons que são "empurrados" pela fonte de tensão) é conduzida entre os eletrodos do sistema eletroforético graças aos íons presentes na solução tampão. Está diretamente relacionado à tensão.

Em relação à solução tampão

A composição, a força iônica e o pH da solução tampão são os principais parâmetros que afetam uma “corrida” eletroforética, pois influenciam diretamente algumas propriedades das amostras, principalmente a carga elétrica.

Por quê? A solução tampão estabiliza o pH do meio de suporte onde ocorre a eletroforese. Sua composição pode afetar o deslocamento das partículas migratórias e também a concentração iônica, pois está diretamente relacionada à corrente.

Em relação ao meio de suporte

Os diferentes tipos e formatos de eletroforese também têm diferentes meios de suporte nos quais ocorre a migração e onde pode ser "gravada" posteriormente.

A taxa de migração das moléculas submetidas à eletroforese depende do tipo de meio de suporte, que geralmente deve ser inerte.

Suas características de absorção, eletroendo-osmose (capacidade de movimento de um líquido através de uma membrana sob a influência de um campo elétrico) e sua capacidade de peneiramento molecular são importantes.

Exemplos de uso de eletroforese

Exemplos clássicos de técnicas eletroforéticas usadas em biologia e biotecnologia incluem:

- Eletroforese em géis de agarose (do inglês Eletroforese em gel de agarose)

- Eletroforese em géis de acrilamida sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio)

- Eletroforese em géis de acrilamida sob condições nativas (BN-PAGE, do inglês Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul)

- Eletroforese bidimensional (2D-PAGE, do inglês Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional)

- Eletroforese capilar (do inglês Electroforese capilar)

- Foco isoelétrico (do inglês Isoelectrofocusing)

- Eletroforese de campo pulsado (do inglês Eletroforese de campo pulsado)

Referências

Beck, Kevin. (2020, 25 de maio). Os tipos de eletroforese. Sciencing.com. Obtido em sciencing.com
Essays, UK. (Novembro de 2018). Tipos e aplicações de eletroforese. Obtido em ukessays.com
Nelson, D. L., Lehninger, A. L., & Cox, M. M. (2008). Princípios de bioquímica de Lehninger. Macmillan.
Parmar, P. (agosto de 2018). Eletroforese: Significado, Definição e Classificação (com Diagrama). Bio Technology. Obtido em biotechnologynotes.com
Perrett, D. (2010). 200 anos de eletroforese. Cromatog. Hoje, 4-7.
Righetti, P. G. (2005). Eletroforese: a marcha das moedas, a marcha das moedas. Journal of Chromatography A, 1079 (1-2), 24-40.
Rilbe, H. (1995). Algumas reminiscências da história da eletroforese. Eletroforese, 16 (1), 1354-1359.
Vesterberg, O. (1993). Uma breve história dos métodos eletroforéticos. Electroforese, 14 (1), 1243-1249.
Vinayagam, M. (sem data). Fatores que afetam a eletroforese. Academia.edu. Recuperado de academia.edu